一、Eg95抗原基因克隆
1.基因来源与特性：
Eg95抗原基因在细粒棘球绦虫六钩蚴期表达，具有株系间的高度保守性，是一种可以诱导机体免疫保护的有效的疫苗候选分子。
Eg95基因编码一个由156个氨基酸残基组成的蛋白质，理论蛋白分子质量为17.061KDa，等电点为9.71。
2.克隆方法：
利用PCR技术从细粒棘球蚴中扩增出Eg95基因DNA或cDNA。
设计特异性引物，以细粒棘球蚴基因组DNA或cDNA为模板进行PCR扩增。
将扩增产物克隆到适当的载体（如pMD19-T载体）上，转化大肠杆菌感受态细胞，经抗生素筛选获得重组子。
对重组子进行DNA测序，确认Eg95基因的正确克隆。
3.序列分析：
利用GenBank/BLAST功能对克隆到的Eg95基因序列与GenBank中已有的Eg95基因家族成员进行序列比较分析。
结果表明，不同地理株的Eg95基因序列存在一定差异，但编码区高度保守。
二、原核质粒构建
1.载体选择：
选择适当的原核表达载体（如pET系列载体、pGEX系列载体等），这些载体通常具有强启动子、多克隆位点和便于纯化的标签（如His标签、GST标签等）。
2.构建方法：
将克隆到的Eg95基因片段通过限制性内切酶消化和T4 DNA连接酶连接的方式克隆到原核表达载体上。
转化大肠杆菌感受态细胞，经抗生素筛选和酶切鉴定获得阳性克隆。
对阳性克隆进行测序确认，确保Eg95基因以正确方向插入到载体中。
3.表达与纯化：
在IPTG等诱导剂的诱导下，重组菌株表达Eg95融合蛋白。
通过SDS-PAGE电泳和Western-blotting试验等方法验证融合蛋白的表达情况。
利用亲和层析等方法对表达的融合蛋白进行纯化。
