质粒 DNA 的分离方法比较（以 E.coli 为例）

质粒 DNA 的分离方法多种多样，每种方法都有其独特的原理和适用范围。以下是以 E.coli 为例，对几种常见的质粒 DNA 分离方法的比较：

1. 碱裂解法

原理：利用强碱性条件（NaOH 和 SDS）破坏细胞壁和细胞膜，使蛋白质和染色体 DNA 变性，而质粒 DNA 由于其共价闭环结构保持完整。随后通过调节 pH 值使变性的蛋白质和染色体 DNA 沉淀，质粒 DNA 则留在上清液中。

优点：

操作简单，成本低廉。

适用于大多数 E.coli 菌株。

可用于小量至大量制备。

缺点：

提取的质粒 DNA 纯度可能不够高，需要进一步纯化。

对大质粒（>15kb）的提取效率可能较低。

2. 煮沸裂解法

原理：将细菌悬浮于含有 Triton X-100 和溶菌酶的缓冲液中，通过沸水浴加热使细胞裂解，蛋白质和染色体 DNA 变性，而质粒 DNA 保持超螺旋结构。随后通过离心去除变性的蛋白质和染色体 DNA，回收上清液中的质粒 DNA。

优点：

操作简单，时间短。

适用于小质粒（<15kb）的小量至大量制备。

对大多数 E.coli 菌株有效。

缺点：

条件剧烈，易造成质粒断裂，回收率较低。

不适用于释放大量糖类的 E.coli 菌株（如 HB101 及其衍生菌株）。

3. SDS 裂解法

原理：将细菌悬浮于等渗的蔗糖溶液中，用溶菌酶和 EDTA 处理破坏细胞壁，再用 SDS 裂解去壁细菌，温和地释放出质粒 DNA。随后通过酚/氯仿抽提和乙醇沉淀纯化质粒 DNA。

优点：

条件温和，适用于大质粒 DNA 的提取。

提取的质粒 DNA 纯度较高。

缺点：

产率可能不高，因为部分质粒 DNA 会缠结在细胞碎片上而丢失。

操作相对复杂，需要较多的试剂和步骤。

4. 试剂盒法

原理：通常采用改良的 SDS-碱裂解法，结合硅胶膜在高盐及低 pH 条件下结合 DNA，在低盐及高 pH 条件下洗脱的原理，实现质粒 DNA 的快速纯化。

优点：

操作简便，快速高效。

提取的质粒 DNA 纯度高，可直接用于后续实验。

适用于多种样本类型。

缺点：

成本较高。

可能不适用于某些特殊菌株或质粒。

5. 氯化铯-溴化乙锭（CsCl-EB）密度梯度超速离心法

原理：利用质粒 DNA 和染色体 DNA 在 CsCl-EB 密度梯度中的浮力密度差异，通过超速离心实现分离。

优点：

分辨率高，纯化效果好。

可用于分离不同构型的质粒 DNA（如超螺旋、开环和线性）。

缺点：

操作繁琐，需要昂贵的设备和试剂。

耗时长，不适合大规模制备。

6. 其他方法

小量一步提取法：直接将酚/氯仿与细菌培养物混合，同时完成细胞裂解与蛋白质变性，通过离心分离质粒 DNA。操作简单快速，但纯度可能不高。

磁珠法：利用磁珠的磁性吸附 DNA，通过洗涤和洗脱实现纯化。操作简便，适用于自动化操作，但成本较高。

 

总结与推荐

1.小量制备：可选择碱裂解法或煮沸裂解法，操作简单，成本低廉。

2.大量制备：可选择 SDS 裂解法或试剂盒法，提取的质粒 DNA 纯度较高。

3.高纯度要求：可选择 CsCl-EB 密度梯度超速离心法，但操作繁琐，成本较高。

4.自动化操作：可选择磁珠法，适合大规模样本处理。

 

根据实验需求和条件，选择合适的方法进行质粒 DNA 的分离和纯化。