一、基本原理

1.密度差异

红细胞密度较高（约1.09–1.12 g/mL），而死细胞（因膜破裂导致内容物外泄）密度可能降低或形成碎片。

有核细胞（如淋巴细胞、单核细胞）密度介于1.07–1.09 g/mL之间。

通过选择特定密度的分离介质，可使红细胞和死细胞沉降到底部，而有核细胞悬浮于上层或界面。

2.分离介质

常用介质包括Percoll（聚蔗糖-泛影葡胺）、Ficoll（聚蔗糖）或碘克沙醇（OptiPrep）。

介质可形成连续或不连续密度梯度，前者分离效果更精细，后者操作更简便。

 

二、操作步骤

1.制备密度梯度

不连续梯度：将不同密度的介质分层铺入离心管（如底层1.09 g/mL，上层1.07 g/mL）。

连续梯度：通过梯度混合仪制备密度从高到低的连续介质层。

2.样本处理

将细胞悬液缓慢铺于梯度介质上层，避免破坏梯度。

样本需预先稀释（如用PBS或培养基）以降低黏度，确保细胞均匀分布。

3.离心条件

转速：800–1200 g（低速离心，避免细胞损伤）。

时间：20–30分钟（根据介质类型和样本体积调整）。

刹车设置：低速或无刹车，防止细胞层扰动。

4.分离与收集

离心后，红细胞和死细胞沉降至管底，有核细胞形成界面层或悬浮于特定密度区域。

使用移液管小心吸取目标细胞层，避免吸入下层杂质。

 

三、关键注意事项

1.介质选择

Percoll分离效果最佳，但需现配现用；Ficoll操作简便，但可能残留毒性。

根据细胞类型调整介质密度（如淋巴细胞富集需1.077 g/mL，单核细胞需1.065 g/mL）。

2.样本处理

样本需过滤（如40 μm滤网）去除大块杂质，避免堵塞离心管。

抗凝剂（如EDTA）可能影响细胞活性，需根据实验需求选择。

3.离心参数优化

转速过高或时间过长可能导致细胞损伤或分离不彻底。

建议通过预实验确定最佳条件（如不同转速下的细胞回收率）。

4.后续处理

收集的细胞需洗涤（如用PBS离心2次）以去除残留介质。

活力检测（如台盼蓝染色）和计数（如血细胞计数板）确保细胞质量。

 

四、优势与局限性

1.优势

高效分离红细胞和死细胞，回收率高（>90%）。

适用于大体积样本（如骨髓、外周血）。

可同时富集特定细胞亚群（如通过调整介质密度）。

2.局限性

操作复杂，需专业设备（如梯度混合仪）。

介质成本较高，且可能引入污染物。

对细胞密度差异小的样本（如成熟红细胞与网织红细胞）分离效果有限。

 

五、应用实例

1.外周血单个核细胞（PBMC）分离

使用Ficoll-Paque（密度1.077 g/mL）分离PBMC，去除红细胞和粒细胞。

肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）富集

通过Percoll梯度离心去除肿瘤组织中的红细胞和死细胞，富集TIL。

2.干细胞分离

结合磁珠分选和密度梯度离心，从骨髓中分离造血干细胞。

 

六、常见问题与解决方案

问题1：细胞回收率低

原因：离心速度不足或介质密度不匹配。

解决：优化离心参数，调整介质密度。

问题2：红细胞残留

原因：梯度破坏或吸取细胞层时操作不当。

解决：确保梯度稳定，使用细口径移液管精确吸取。

问题3：细胞活力下降

原因：离心时间过长或介质毒性。

解决：缩短离心时间，更换低毒性介质（如OptiPrep）。