树突细胞 Dendritic cells (DCs)最早由Ralph M. Steinman在小鼠的外周淋巴结组织中发现，是哺乳动物免疫系统中的抗原呈递细胞。它们的主要功能是捕获、处理抗原并将其呈递给幼稚T细胞；在病原体识别时上调MHC分子和共刺激受体；产生极化细胞因子，促进病原体特异性效应T细胞分化和激活；通过分泌诱导调节性T细胞分化的耐受性细胞因子促进自身耐受。它们在先天免疫系统和适应性免疫系统之间起到传递信息的作用。根据其功能和表型的不同，主要可以分为经典型DC（classical DC，cDC 或称Myeloid DC，包括cDC1（CD141/BDCA-3+）和cDC2（CD1c/BDCA-1+））、单核细胞样炎性DC（monocyte-like inflammatory DC ，MoDC）和浆细胞样DC（plasmacytoid DC, pDC）。其中，MoDC在表型和功能上接近cDC2，同样具有抗原递逞和激活T细胞的作用。在体外研究中，经常使用这种类型的DC细胞作为研究对象。本方案中提及的DC均为单核细胞来源的DC。
一、材料和试剂
1.RPMI 1640 培养基
2.胎牛/人血清、庆大霉素（Gentamycin）、L-谷氨酰胺、β-巯基乙醇（β-mercaptoethanol）
3.CD14+单核细胞磁珠分选试剂盒
4.GM-CSF、IL-4、LPS（方案1）
5.TNF-α、IL-1β、IFN-γ、PGE2、Poly(I:C)、CL075 (TLR7/8 Agonist)（方案2）
二、单核细胞分离和纯化
1. PBMC分离:
使用Ficoll-Hypaque密度梯度离心法从健康志愿者的外周血中分离PBMC。
2. 单核细胞纯化:
使用CD14+磁珠分选试剂盒分离纯化单核细胞，并计数。
三、树突细胞的诱导
方案1：
1. 在室温预热并配置诱导培养基：基础培养基（RPMI 1640 + 50 μg/mL 庆大霉素 + 2 mM L-谷氨酰胺 + 50 μM β-巯基乙醇）+ 10% FBS + 50 ng/mL GM-CSF + 35 ng/mL IL-4
2. 使用诱导培养基重悬单核细胞，并调整细胞浓度至1 x 10^6个细胞/mL。
3. 在六孔板中加入3 mL细胞悬液（如果使用25 cm2培养瓶加入10 mL细胞悬液），37℃、5% CO2的细胞培养箱中培养7天。
4. 每三天更换一次培养基（半换液）。
注意：在去除培养基时要小心，以免吸走细胞。或者，可以将废弃的培养基转移到无菌的15 mL离心管中，然后以300 x g离心8分钟。在15 mL离心管底部形成的细胞沉淀可以重悬于新鲜的诱导培养基并加入到同一孔或瓶中。
5. 树突细胞成熟诱导：在第7天向细胞悬液中添加1 μg/mL的LPS并孵育48小时来诱导MoDC的成熟。
注意：除了LPS外，TNF-α和CD40L也能促进DC细胞的成熟。
6. 收集细胞，并检测树突细胞的表型和功能。
方案2：
1. 诱导培养基配置
未成熟DC诱导培养基（imDC-M）：基础培养基+ 1.5% human serum + 100 ng/mL GM-CSF + 20 ng/mL IL-4
成熟DC诱导培养基（mDC-M）：基础培养基+ 1.5% human serum + 10 ng/mL TNF-α + 10 ng/mL IL-1β + 5000 U/mL IFN-γ + 250 ng/mLPGE2 + 20 ng/mL Poly(I:C) + 1 μg/mL CL075
2. 使用imDC-M单核细胞，并调整细胞浓度至1 x 10^6个细胞/mL。
3. 在25 cm2培养瓶加入10 mL细胞悬液，37℃、5% CO2的细胞培养箱中培养48小时。
4. 更换mDC-M，继续培养24小时。
5. 收集细胞，并用含0.5% human serum PBS清洗细胞两次，用于后续的表型和功能鉴定。
四、树突细胞的鉴定
1. 表型：
表面标志物：Lin- cD1a+ CD1c/BDCA-1+CD11b+ CD110+ CD14+ Fcγ RI/CD64+ Fcε Rlα+ HLA-DR+MMR/CD206+ SIRPa/CD172a+
未成熟DC VS. 成熟DC
2. 功能：
2.1第三信号检测
目的：模拟DC与活化的T细胞的相互作用
流程：
实验组- MoDC (2x10^4 个细胞/孔) + CD40 L cell Line (5x10^4 个细胞/孔)
对照组- MoDC (2x10^4 个细胞/孔)；CD40 L cell Line (5x10^4 个细胞/孔)
96孔板，培养24小时，每组8个重复孔
检测指标- IL-10 & IL-12
2.2细胞迁移实验
目的：DC细胞的趋化性验证
流程：
基础培养基- RPMI 1640 + 500 U/ml GM-CSF + 250 U/ml IL-4 + 1% human serum +
CCL19 100 ng/mL
Transwell试验- 下室中加入 600 μL 基础培养基 & CCL19（阴性对照无），上室中加入MoDC细胞（ 2x10^5个细胞/孔）
37℃孵育2小时，对上下小室中DC细胞计数。
2.3 NK细胞活化及杀伤实验
目的：评价DC活化NK细胞并介导杀伤的性能
流程：
培养基- RPMI 1640 + 2 mM L-谷氨酰胺 + 1 mM 丙酮酸钠 + 50 μg/mL 庆大霉素 + 10% human serum
1x10^6个NK细胞与1x10^5自体MoDC共培养24小时，(1) 收集细胞上清检测IFN-γ水平；(2) 收集细胞，使用CD3 (FITC)、CD56 (APC)、CD69 (PE)抗体检测活化NK细胞比例。
细胞毒性实验- NK细胞（效应细胞，E）与1.5×10^3个K562细胞（靶细胞，T）按照E:T细胞比率为10:1、5:1、2.5:1和1.25:1进行共培养4小时，检测铬释放量并计算裂解效率。
注意：此处使用的是铬释放试验来确定K562的死活，需要使用到闪烁计数器，且具有一定的辐射风险。可采用其他方式，如荧光素（钙黄绿素Calcein-AM、刃天青Resazurin）等其他检测细胞死活的方法进行替代。
2.4 T细胞活化及杀伤实验
目的：评价DC活化自体和异体T细胞并介导杀伤的性能
流程：
I 异体T细胞（Allogeneic T lymphocytes）的活化及杀伤
T细胞培养基- RPMI 1640 + 12.5 mM HEPES + 4 mM L-谷氨酰胺 + 50 μg/mL 庆大霉素 + 10% human serum
细胞：供体细胞- HLA-A2- 来源的PBMC；moDC细胞 -HLA-A2+ 来源
1x10^6个PBMCs和1x10^5 个MoDCs在T细胞培养基中共培养7天，收集细胞，流式检测T细胞（CD4 & CD8）中IL-4、IFN-γ的表达量。
II 自体T细胞（Autologous T lymphocytes）的活化及杀伤
T细胞培养基- RPMI 1640 + 12.5 mM HEPES + 4 mM L-谷氨酰胺 + 50 μg/mL 庆大霉素 + 10% human serum
细胞：供体细胞- HLA-A2+ 来源的PBMC & MoDC
免疫原：抗原肽- MART- 1/Melan-A寡肽 (ELAGIGILT)；CEF肽库
MoDC与1 mg/mL抗原肽预处理2小时。
1x10^6个PBMCs和1x10^5 个MoDCs在T细胞培养基中共培养7天。
收集细胞。使用标准的4小时铬释放实验评估杀伤活性。靶细胞使用Mel624.38（HLA-A2+，MART-1/Melan-A+）作为阳性靶细胞，MelA375（HLA-A2+，MART-1/Melan-A2-）作为阴性靶细胞。
