材料与试剂
 

细胞：新鲜或冷冻的人PBMC

分选试剂：人CD4+ Naive T细胞分选试剂盒（如R&D systems磁珠分选试剂盒）

培养基：RPMI-1640，含10%胎牛血清（FBS）、1%青霉素/链霉素

细胞因子：IL-2、IL-1β、IL-6、IL-23、TGF-β1

其他试剂：抗人IFN-γ抗体、抗人IL-4抗体、抗人IL-3抗体、抗人IL-28抗体、β-巯基乙醇、PMA、Monensin

实验步骤

1.PBMC分离

1.1. 全血分离：

将全血样本与等体积的PBS混合。

将混合液慢慢层析在Ficoll-Paque密度梯度离心液上。

在室温下以400 g离心30分钟（升速为1，降速为0）。

1.2. 收集PBMC：

离心后，分层会形成3层：上层为血浆和PBS、下层为红细胞和颗粒细胞，中层为淋巴细胞分离液。PBMC为下层顶端和中层底端的白色薄膜层。

小心收集PBMC层，并转移至新的离心管中。

用PBS洗涤PBMC 2次，每次以300 g离心10分钟。

2. Naive T细胞分选

2.1. 磁珠标记：

按照生产商提供的说明书使用CD4+ Naive T细胞分选试剂（Biotinylated Antibody Cocktail）标记PBMC。一般来说，需在4℃下孵育20-30分钟。

加入链霉亲和素（Streptavidin）偶联的磁珠，在4℃下继续孵育20-30分钟。

2.2. 磁珠分选：

将孵育用的U型管置于专用磁力架上，室温静置5分钟。

将管中的细胞导入新的U型管中，即为Naive T细胞

为确保纯度，可以重复分选步骤。

3. Th17细胞诱导：

1). 激活抗体包被

使用PBS重溶抗CD3和抗CD28抗体，并将其在同一15 mL离心管中稀释至工作浓度分别5 µg/mL和5 µg/mL。

按照1 mL/孔加稀释后的抗CD3/CD28抗体至24孔板，37℃细胞培养箱中孵育60分钟（在4℃过夜孵育效果更佳）。

使用PBS将包被后的孔清洗两次。

注意：如果使用诸如Dynabeads之类的磁珠激活剂，则无需该步骤及相应的试剂。在细胞铺板时，按照1:1的比例进行混合即可。

2). 诱导培养基Th17-DM配置

Th17-DM：RPMI 1640完全培养 + IL-2 (20 ng/mL) + IL-1β (10 ng/mL) + IL-6 (40 ng/mL) + IL-23 (20 ng/mL) + TGF-β1 (10 ng/mL) + 抗人IFN-γ抗体 (10 μg/mL) + 抗人IL-4抗体 (10 μg/mL) + β-巯基乙醇 (50 μM)

注意：成分确定的T细胞无血清培养基可以替代RPMI 1640完全培养基（含血清），该类培养基的批次稳定性较含血清培养基要好。3). 细胞铺板及分化

使用Th17-DM重悬分选后的Naive T细胞，将浓度调整以2×105 cells/mL

按照1 mL/孔的量加入已包被抗CD3/CD28抗体的24孔板中，在37℃，5%CO2的环境下持续培养7天。每1~2天进行半换液。

4. 细胞鉴定：

取部分细胞，用含有50 ng/mL PMA的Th17-DM重悬，并于细胞培养箱中孵育1小时。

加入3.0 μM蛋白转运抑制剂Monensin，继续培养3小时。

使用流式细胞术对细胞进行鉴定

胞外标志物：CD4、TGF-βR、IL-6 Rα、IL-21R、IL-23R

胞内/核内标志物：IL-17A、RORα/NR1F1、RORγt/RORC2/NR1F3