聚乙烯亚胺（Polyethyleneimine，PEI）是一种合成聚合物，在pH中性溶液中具有极高的正电荷密度。带正电的PEI与带负电的DNA紧密结合，赋予DNA净阳离子电荷，使其能够进入细胞。PEI具有较强的细胞转染能力，并且经济廉价，常用于转染HEK293和CHO细胞的非病毒载体，其应用包括重组蛋白、抗体和病毒的生产。本方案主要介绍PEI转染试剂的配置，以及HEK293细胞系转染方案。
一、 PEI转染试剂（1 mg/mL）的配置
通常而言，研究人员所购置的PEI为冻干粉，因此需要进行重溶配置成母液后使用。
材料：PEI冻干粉、去离子水、0.1 M的NaOH溶液、0.2 μm滤器、离心管、pH计
实验流程：
1. 精确称取100毫克PEI粉末，溶解于80毫升去离子水。搅拌几分钟以溶解粉末。
2. 使用pH计测量充分溶解后的PEI溶液，并逐滴加入0.1 M NaOH溶液，调整pH至7.0（偏差不超过0.1）。此过程大约需要使用10 mL的NaOH溶液。
3. 向调整pH值后的PEI溶液中加入去离子水，使其总体积达到100 mL。
4. 在无菌环境下，使用0.2μm的针头过滤器将该溶液过滤到无菌离心管中。
5. 分装冻存与-20℃，避免反复冻融，不要使用已冻融超过一次的分装液。4℃保存时，最长为为6个月。
注意：如果配置1 L的PEI溶液，务必将NaOH溶液的浓度提高至1 M。
二、 HEK293细胞（贴壁）基因转导
材料：PEI转染试剂、HEK293培养基DMEM，37℃备用。
注意：转染会受血清抑制，因此建议使用无血清或化学成分确定的培养基。
HEK293细胞
待转质粒DNA（pDNA）
注意：质粒的性质也会影响转染的效率，通常要求提纯后的质粒满足高纯度（纯度OD260/OD280的比值应在1.8-2.0之间）、低内毒素（内毒素水平应低于0.1 EU/μg DNA）、高比例超螺旋型（supercoiled）质粒（含量高于80%）以及高浓度和稳定性等要求。
实验流程：
1. 转染前一天，接种细胞至细胞培养瓶或者培养皿。接种密度约5x10^4个细胞/cm2。
2. 次日，当细胞至50%~80%融合程度时，更换无血清培养基（或基础培养基DMEM），开始转染。
3. 转染试剂的配置（10 mL细胞培养基体系）
a. 取500 μL DMEM，按照每10^6个细胞1.0 μg pDNA的量加入质粒，并充分混匀。
b. 取500 μL DMEM，按照每10^6个细胞3.0 μg PEI的量加入转染试剂，并充分混匀。
c. 将稀释后的PEI溶液加入到质粒溶液中，并立即涡旋混匀。充分混匀后，室温静置10分钟。
注意：通常用于稀释PEI和质粒的培养基体积为细胞培养瓶或培养皿中培养基体积的5%。如10-cm培养皿中，加入10 mL培养基，稀释时，各取500 μL DMEM进行稀释；6孔板中，每孔加入1 mL培养基，整板转染时，可各取400 μL DMEM进行稀释，然后每孔加入100 μL pDNA-PEI混合溶液。
注意：可以通过质粒和PEI的用量来改善细胞转染效率。以转染10^6个细胞为例，PEI的用量可以在2.0 ~4.0 μg之间调整，pDNA可以在1.0 ~ 2.0 μg之间调整，共孵育时间可以在5 ~ 15分钟之间调整。
4. 将pDNA/PEI混合物逐滴滴加到含新鲜无血清培养基中，轻轻混匀后，置于37℃，5% CO2环境中培养。
注意：如果使用含血清的培养基，可于转染6小时后，跟换含血清培养基。但是这样会在一定程度上降低转染效率。如果在转染的过程中出现了细胞毒性效应，建议优先降低质粒和（或）PEI的量，换液是最次的选择。
三、 HEK293细胞（悬浮）基因转导
HEK293细胞悬浮培养通常用于工业中如重组蛋白、病毒等大规模的生产。通常使用低血清、无血清或者成分确定培养基进行细胞培养和基因表达。Thermo Fisher Scientific、Cytiva、Lonza、FUJIFILM Irvine Scientific等国际知名培养基供应商均有相应的产品，本方案中以X-Medium表示。
材料：PEI转染试剂、HEK293表达培养基X-Medium，37℃备用。
HEK293细胞
待转质粒DNA（pDNA）
实验流程：
1. 转染前一天，HEK293细胞传代，使其在次日转染时，细胞密度能够达到1.5~2.0x10^6个细胞/mL。同时，细胞活率要大于95%。
2. 将细胞用培养基稀释到1.0x10^6个细胞/mL。
3. pDNA的稀释：配置浓度为20 μg/mL的pDNA溶液，体积为细胞培养最终体积的5%。如细胞培养所需体积为100 mL，则取5 mL新鲜培养基，加入100 μg的pDNA。
4. PEI的稀释：将1 mg/mL的母液使用培养基稀释成至60 μg/mL，体积为细胞培养最终体积的5%。如细胞培养所需体积为100 mL，则取5 mL新鲜培养基，加入300μL 1 mg/mL的PEI。
5. 将稀释后的pDNA和PEI混合，颠倒几次并涡旋混匀，室温静置10分钟。使用前轻轻颠倒关闭的容器一次。
注意：可以通过质粒和PEI的用量来优化细胞转染效率。按每升培养基体积计算， PEI的用量可以在1.50 ~4.50 mg之间调整，pDNA可以在0.75 ~ 1.50 mg之间调整，共孵育时间可以在5 ~ 15分钟之间调整。
6. 每90 mL待转染培养液使用10 mL的pDNA/PEI混合物。逐滴将混合物加入培养液中并混匀。
7. 置于37℃，5% CO2环境中培养。转染6小时后，如有必要，可向培养体系中额外加入额外的促进基因表达的添加剂。持续监控蛋白的表达量并记录。通常，分泌型蛋白含量会在转染5~7天后达到峰值。
注意：无论是贴壁转染还是悬浮转染，都可以使用带GFP的质粒作为阳性对照，进而优化转染条件。一般情况下，转染后48小时，GFP的表达比例应该在70%以上。
