一、关于洗脱
1.首先，针对洗脱过程中的一些关键步骤，如膜必须完全浸泡在洗脱液中并进行良好的密封，然后在水中进行充分浸泡，以确保膜受热均匀。这一步骤至关重要，因为若膜受热不均会导致压出的总蛋白和内标不均一，在结果分析时将无法进行准确比较，从而影响实验结果的准确性。
2.需要注意的是洗脱液的作用是去除已结合的抗体，但同时也会去除部分蛋白，从而导致蛋白信号变得较弱。实验结果表明，使用水浴时温度有时会不太稳定，设定55℃时温度常常会超出，导致更多蛋白被去除。因此建议将洗脱温度设定为50℃，30分钟，在保证有效去除已结合抗体的同时，也更能保护蛋白不受过度影响。
3.抗体洗脱液的配方为：取0.5mol/L的Tris-Hcl（pH=6.8）25ml、4g SDS和1.4ml β-巯基乙醇，加入纯水定容至200mL。这样配制的洗脱液可以有效实现抗体的清洗，并保护蛋白的完整性。
二、磷酸化抗体选择
1.区分非磷酸化的抗体和磷酸化的抗体：
区分非磷酸化的抗体和磷酸化的抗体的能力是至关重要的。通常情况下，非磷酸化的抗体既可以识别非磷酸化的蛋白，也可以识别磷酸化的蛋白；而磷酸化的抗体只能识别磷酸化的蛋白，无法识别非磷酸化的蛋白。然而，由于抗体识别表位的差异，还需考虑到一些非磷酸化的抗体可能只能识别非磷酸化的蛋白，而无法识别磷酸化的蛋白。
2.选择对应的磷酸化位点的抗体：
选择磷酸化抗体时，确保选用对应目标蛋白的磷酸化位点的抗体至关重要。以IkBα为例，其主要磷酸化位点包括S32、S36和Y42。因此，在选取磷酸化抗体之前，务必查阅相关文献，了解在您的实验条件下或根据目标蛋白的磷酸化情况，确定可能发生磷酸化的位点，或根据磷酸激酶的信息来推断可能的磷酸化位点。
3.酸化抗体的说明书一定要仔细看：
阅读磷酸化抗体的说明书至关重要。最好根据生产商提供的操作指导来进行实验，这是保证实验成功的关键。不同磷酸化抗体公司可能推荐不同的操作步骤。例如，CST推荐使用脱脂奶粉进行封闭，以BSA配制一抗和二抗。最重要的是，确保选择质量好、特异性强、效价高的抗体，并且经过验证且在文献中有相关发表记录的抗体，这样可以更容易得到可信的实验结果。
三、总蛋白和内参对照都要做
在进行磷酸化蛋白检测时，我们需要同时设定两个内参。首先，一个内参是磷酸化蛋白对应的总蛋白。举例来说，如果需要检测Akt磷酸化情况，就需要同时进行Akt总蛋白和Akt磷酸化抗体的实验。仅仅检测到磷酸化蛋白表达量的变化并不能充分说明问题，只有当磷酸化蛋白与总蛋白的比值发生变化时，我们才能确认磷酸化水平发生了改变。
另一个重要的内参是常用的参考蛋白，如actin和GAPDH等。这些常规内参被用作体系的对照，以确保样品上样量的一致性，从而排除实验体系本身的影响。这样，在磷酸化蛋白检测中同时考虑这两个内参是非常重要的，可以更准确地评估磷酸化水平的变化。
