细胞实验是生物医学研究中的基础工具，也是科学家探索生命现象、疾病机理及药物反应的重要手段。无论是癌症研究、免疫疗法还是药物筛选，细胞实验都在其中扮演着不可替代的角色。掌握基本的细胞实验技术，不仅能够帮助科研人员深入理解细胞的生物学行为，还能为后续的更复杂实验奠定坚实基础。

一、实验准备工作

1. 基本设备与耗材

要开始细胞实验，首先需要准备好一些基础设备和耗材：

• 培养箱：用于提供细胞生长所需的恒定温度和湿度环境，通常为37℃和5%的二氧化碳（CO₂）。
• 培养基：含有细胞生长所需的营养成分，最常见的为DMEM、RPMI-1640等，每种细胞系对培养基的需求不同。
• 血清：一般是胎牛血清（FBS），它为细胞提供生长因子和其他营养物质，通常在培养基中按10%或20%的比例添加。
• 细胞培养耗材：如培养皿、培养瓶、移液器、无菌移液管、枪头等，确保这些耗材在实验前彻底消毒，避免交叉污染。

2 .常用细胞系的选择

不同研究领域常用的细胞系各不相同，常见的有：

• HeLa细胞：来源于人类宫颈癌，是最常用于药物筛选和癌症研究的细胞系。
• 293T细胞：源自人类胚胎肾细胞，经常用于转染实验。
• RAW 264.7细胞：小鼠巨噬细胞系，适合用于免疫研究。

在选择细胞系时，研究者应考虑实验目的、细胞的生长特性和代谢需求，并确保合适的培养条件。

3 .无菌操作的关键性

细胞实验最忌细菌、真菌等微生物的污染。一旦培养物受到污染，实验结果将无法保证准确性，甚至会导致实验失败。

因此，无菌操作是细胞实验成功的关键：

• 使用无菌工具：所有培养耗材、移液器枪头、培养基等都需经过消毒或无菌过滤处理。
• 在生物安全柜内进行操作：生物安全柜能提供局部无菌环境，避免空气中的污染物进入实验区域。
• 严格遵循消毒步骤：使用75%酒精擦拭工作台，移液枪、手套等必须保持清洁并进行定期更换。

 

二、细胞培养流程

1. 细胞复苏

从冷冻状态复苏细胞是进行细胞实验的第一步。冷冻保存的细胞保存在液氮中，复苏过程如下：

• 取出冷冻细胞：将冻存管从液氮中取出，立即置于37℃水浴中，轻轻摇动，快速融化（约1-2分钟）。
• 转移细胞：一旦细胞完全融化，迅速将细胞悬液转移到盛有预热的培养基的15ml离心管中，离心去除冷冻保护剂（通常为DMSO）。
• 接种细胞：离心后将细胞沉淀重新悬浮于新鲜培养基中，转移至培养瓶或培养皿中，然后置于培养箱中培养。

 

2. 细胞传代

随着细胞生长，培养瓶中的细胞会达到一定的密度，此时需要进行传代操作，以维持细胞的健康生长。

传代步骤如下：

观察细胞生长情况：通过显微镜观察细胞的生长状态，当细胞覆盖培养瓶底面积的 80%-90% 时即可进行传代。

• 消化细胞：对于贴壁细胞，使用胰酶消化细胞（通常为0.25%胰酶），轻轻摇晃培养瓶，使细胞脱落。
• 细胞传代：将消化后的细胞转移到新鲜培养基中，稀释后接种到新的培养瓶中进行传代。

3 .细胞计数

在实验过程中，了解细胞的密度和活性是必要的，细胞计数是重要的一步。常见方法为：

• 台盼蓝染色法：台盼蓝能够染色死细胞而不染色活细胞，使用血球计数板进行细胞计数，计算细胞存活率。
• 细胞计数器：通过自动化设备计数细胞，节省时间并提高计数准确性。

 

三、细胞实验的常见问题及解决方案

1 .细胞污染的预防与处理

细胞培养中最常见的问题之一就是污染。常见的污染源包括细菌、真菌、酵母和支原体：

• 预防措施：严格遵守无菌操作原则，定期使用支原体检测试剂盒检测细胞是否受污染。
• 处理措施：一旦确认细胞污染，立即丢弃被污染的培养瓶，并清洁培养环境，消毒所有相关设备。

2 .细胞生长状态异常

当细胞出现生长不良或死亡时，可能的原因包括：

• 培养条件不合适：培养基、温度、CO₂浓度等不符合细胞的需求。
• 细胞过度传代：细胞传代次数过多，容易导致细胞老化或失去特性，建议使用低传代的细胞。
• 营养不足或废物堆积：定期更换培养基，保持细胞的营养供应。

3.如何调节培养条件以优化细胞生长

为了保证细胞的最佳生长状态，研究者应根据具体细胞类型进行培养条件的微调：

• 优化培养基：根据细胞的需求，调整培养基中的血清浓度或添加生长因子。
• 定期观察细胞状态：通过显微镜观察细胞形态，发现异常时及时调整培养条件。
• 培养环境调控：确保培养箱内的温度和湿度稳定，特别是CO₂浓度保持在5%左右。

 

 

四、常见细胞实验的应用与技巧

1 .MTT/CCK-8细胞活性检测

• 原理：MTT和CCK-8是两种常用的细胞活性检测方法。两者的共同点在于，它们都通过测定细胞代谢活性来反映细胞的生存能力。
• MTT法：依赖于线粒体脱氢酶的活性，将MTT（四唑盐）转化为一种不溶性的蓝紫色结晶（Formazan）。这种产物无法溶于水，必须用DMSO溶解后，通过分光光度计检测吸光度（通常在570nm）来反映细胞活性。
• CCK-8法：基于类似的原理，但使用的是WST-8试剂，该试剂被细胞线粒体中的脱氢酶还原，形成一种溶于培养基的橙色产物，直接通过450nm的吸光度检测，无需额外溶解步骤。

操作步骤：

• 细胞接种：在96孔板中接种细胞，通常每孔种植5000-10000个细胞，注意保持相同密度。
• 药物处理：根据实验设计在细胞生长24小时后，加入不同浓度的药物或处理试剂，继续培养24-72小时。
• 加入检测试剂：
• MTT法：加入适量MTT试剂（通常5mg/ml），孵育4小时后，加入DMSO溶解产物。
• CCK-8法：直接加入CCK-8试剂，孵育1-2小时。
• 吸光度检测：使用酶标仪分别在570nm（MTT）或450nm（CCK-8）检测吸光度。吸光度值与细胞活性成正比。

数据解读：

吸光度值越高，表示细胞存活率越高。可以通过对照组数据与处理组比较，计算细胞存活率（如存活百分比）。

• 优势对比：CCK-8法操作简便、检测灵敏，且无毒性残留，可进一步处理细胞，因此相对更适合高通量筛选实验。而MTT法由于需要额外溶解步骤，相对复杂，但仍然是经典的细胞活性检测方法。

2 .Transwell侵袭与迁移实验

• 原理：Transwell系统是研究细胞迁移和侵袭行为的常用方法，通常用于肿瘤细胞或免疫细胞。迁移实验通过检测细胞穿过无基质涂层的多孔膜来量化细胞的运动能力，而侵袭实验则要求细胞穿过涂有基质胶（如Matrigel）的多孔膜，以模拟细胞在体内穿越基底膜的过程。

操作步骤：

• 准备Transwell腔室：根据实验设计，在上腔添加细胞悬液，通常为无血清培养基，而下腔添加含有吸引细胞迁移的培养基（如含有血清或趋化因子的培养基）。
• 侵袭实验特定步骤：对于侵袭实验，需要在Transwell上腔室的膜表面涂布一层Matrigel，模拟基底膜，以考察细胞的侵袭能力。
• 孵育：将Transwell系统置于培养箱中孵育12-48小时，时间根据细胞类型和实验设计而定。
• 染色与计数：孵育结束后，移除上腔未迁移或未侵袭的细胞，固定并染色通过膜迁移或侵袭到下腔的细胞。常用的染色方法为结晶紫或Giemsa染色。
• 计数细胞：通过显微镜观察并计数穿过膜的细胞数量，或者通过溶解染料后的光吸收检测进行半定量分析。

数据解读：

细胞数量或染料吸光度的变化直接反映了细胞的迁移或侵袭能力。对照组与处理组的比较可揭示实验条件对细胞运动能力的影响。

• 实验应用：Transwell实验常用于评估肿瘤细胞的侵袭能力、药物对迁移的影响、或探究细胞与基质的相互作用。

3 .流式细胞术的初步应用

• 原理：流式细胞术（Flow Cytometry，FCM）是一种通过激光检测悬浮细胞群体的光散射和荧光信号，用于分析细胞的大小、内部结构以及特定标志物的表达。它能够同时对多种参数进行定量分析，如细胞周期、凋亡和表面标志物表达。

操作步骤：

• 细胞制备：将细胞处理后，通过胰酶消化悬浮细胞或直接处理悬浮细胞系，并用PBS洗涤，确保细胞呈单细胞悬液。
• 染色：根据实验目的，使用荧光标记的抗体或荧光染料标记细胞。如PI染色用于检测细胞凋亡，BrdU或Ki67用于检测细胞增殖。
• 数据采集：使用流式细胞仪分析细胞。通过激光照射细胞，检测散射光和荧光信号，量化细胞大小、内部颗粒以及荧光强度。
• 数据分析：使用流式软件分析数据，生成细胞群体分布图，如细胞周期分析中的DNA含量直方图。

数据解读：

• 细胞周期分析：流式细胞术可以根据DNA染色后的荧光强度区分G0/G1期、S期、G2/M期的细胞比例，从而评估细胞的增殖状态。
• 凋亡分析：通过PI/Annexin V双染或Caspase 3/7活性检测，流式能够区分早期凋亡、晚期凋亡和坏死细胞。

 

细胞实验是生物医学研究中的核心技术之一。掌握如MTT/CCK-8检测、Transwell迁移实验和流式细胞术等基础操作，可以帮助科研人员更好地探索细胞行为、生物学机制和药物作用。