原代细胞甲基绿-哌咯宁法是一种用于显示细胞内DNA和RNA分布的经典染色方法。
以下是该方法的详细介绍：
基本原理
甲基绿（methyl green）和哌咯宁（pyronin）均为碱性染料，它们可以与带负电荷的磷酸根形成盐。甲基绿分子具有两个正电荷，易与双链DNA分子结合，使原代细胞核内的DNA呈蓝绿色。哌咯宁分子具有一个正电荷，易与单链RNA分子结合，使原代细胞质和核仁内的RNA显示红色。这种染色方法的原理可能与核酸分子的空间构型有关，因为DNA和RNA的聚合程度不同，对染料的亲和力也有所差异。
试剂配制
1.0.2mol/L pH4.8的乙酸缓冲液：
将1.2毫升冰乙酸加入蒸馏水中，定容至100毫升。
在使用时，再加入2.72克乙酸钠（NaAc⋅3H2O），待完全溶解后，即可使用。
2.甲基绿-哌咯宁染色液：
A液：取2克甲基绿加入100毫升pH4.8的0.2mol/L乙酸缓冲液中。
B液：取1克哌咯宁加入100毫升pH4.8的0.2mol/L乙酸缓冲液中。
使用时，将A液和B液按5:2的比例混合即可。
染色步骤
1.细胞准备：
取培养于盖玻片上的贴壁原代细胞，用Hanks液漂洗三次，以去除残留的培养液和杂质。
2.细胞固定：
用70%乙醇溶液固定细胞10分钟，然后取出晾干。固定步骤有助于维持细胞的形态结构，使染色结果更加清晰。
3.染色：
滴加甲基绿-哌咯宁染色液，覆盖盖片样品，染色15分钟。染色时间可根据细胞类型和染色效果进行适当调整。
4.冲洗：
用蒸馏水冲洗盖玻片三次，以去除多余的染色液。
5.分色与干燥：
用95%乙醇进行分色处理，然后晾干。这一步有助于去除背景色，使染色结果更加鲜明。
6.封片与观察：
用二甲苯进行透明处理，然后用光学树胶封片。封片后，可在光学显微镜下观察染色结果。
7.染色结果
在显微镜下观察，可以看到原代细胞核因含有DNA而呈绿色，细胞质及核仁因含有RNA而呈红色。这一结果验证了DNA主要分布在细胞核中，而RNA则主要分布在细胞质和核仁中。
注意事项
1.试剂配制：甲基绿-哌咯宁染色液应现配现用，以确保染色效果。
2.染色时间：染色时间不宜过长或过短，应根据细胞类型和染色效果进行适当调整。
3.细胞处理：在染色前，细胞应经过适当的处理，如固定、漂洗等，以确保染色效果。
4.显微镜观察：观察前应将细胞充分湿润，以避免细胞干燥导致形态变化。同时，使用适当倍数的显微镜观察细胞，以获得清晰的图像。
通过原代细胞甲基绿-哌咯宁法，可以清晰地观察到细胞内DNA和RNA的分布情况，为细胞生物学和医学研究提供重要的实验依据。
