一、实验原理

1.电泳原理：带电颗粒在电场力作用下，会向着与其电性相反的电极移动，这种现象称为电泳。蛋白质是两性电解质，其等电点（pI）通常在pH 4.0至7.5之间。当蛋白质处于pH大于其等电点的溶液中时，会带上负电荷，从而在电场中向阳极移动。

2.血清蛋白质分离：血清中含有多种蛋白质，它们的等电点各不相同。在pH 8.6的缓冲液中，所有血清蛋白质均带负电荷，向阳极移动。由于各种蛋白质在同一pH环境中所带负电荷的数量及分子大小不同，因此在电场中的迁移速度也不同。蛋白质分子越小且所带电荷越多，泳动速度越快；反之，则泳动速度慢。利用这一原理，可以将血清蛋白质分离成不同的区带。

二、实验材料

1.试剂：

巴比妥-巴比妥钠缓冲液（pH 8.6）：用于提供电泳所需的pH环境。

染色液：如丽春红S、氨基黑10B等，用于对电泳后的蛋白质进行染色，使其可见。

漂洗液：用于去除染色后的背景色，使蛋白质条带更加清晰。

透明液：用于使醋酸纤维薄膜透明，便于后续的定量分析。

洗脱液：如氢氧化钠溶液，用于将染色后的蛋白质从薄膜上洗脱下来，进行比色分析。

2.器材：

电泳仪：提供电泳所需的电场。

电泳槽：容纳缓冲液和醋酸纤维薄膜，进行电泳操作。

醋酸纤维薄膜：作为电泳的支持介质，分离血清蛋白质。

点样器、培养皿、滤纸、镊子、直尺、铅笔、剪刀等辅助器材。

三、实验步骤

1.电泳槽的准备：将巴比妥-巴比妥钠缓冲液加入电泳槽中，调节两侧槽内的缓冲液至同一水平面，确保电泳过程中的电流稳定。

2.醋酸纤维薄膜的准备：取一张醋酸纤维薄膜，在无光泽面（涂有醋酸纤维素的一面）上划一条与长轴垂直的线作为点样标记。将薄膜浸入缓冲液中充分浸透后取出，夹于滤纸中吸去多余的缓冲液。

3.点样：用血清加样器将适量无溶血的新鲜血清均匀地点在薄膜的点样标记处，避免样品与薄膜边缘接触，以免影响电泳图谱。

4.平衡：将已点样的薄膜加样面朝下，点样端置于电泳槽的阴极端，使薄膜紧贴于电泳槽支架的盐桥上并保持平直。加上槽盖平衡一段时间后通电电泳。

5.电泳：正确连接电泳槽与整流器，调节电压和电流至适宜范围，进行电泳操作。电泳时间根据实验条件而定，直至电泳区带展开至适宜长度。

6.染色：电泳完毕后，立即取出薄膜浸入染色液中染色一段时间。

7.漂洗：将染色后的薄膜取出，放入漂洗液中反复漂洗，直至背景色脱净，蛋白质条带清晰可见。

8.定量：

洗脱比色法：将漂洗后的薄膜剪下各区带，分别放入试管中加入洗脱液进行洗脱。然后测定各试管的吸光度，计算各蛋白质区带的相对含量。

光密度扫描法：将已透明的薄膜放入光密度计中进行扫描，描记各蛋白区带峰，并计算各蛋白成分的相对含量。

9.计算：根据定量结果，计算血清中各蛋白质组分的相对百分数。

四、实验结果

经过电泳、染色和定量分析后，可以得到血清蛋白质的电泳图谱。图谱上通常可以观察到五条清晰的色带，从正极到负极依次为：清蛋白、α₁-球蛋白、α₂-球蛋白、β-球蛋白和γ-球蛋白。各蛋白质条带的颜色深浅和面积大小反映了它们在血清中的含量。

五、临床意义

血清蛋白质电泳图谱可以为临床疾病诊断提供依据。例如，肾病型电泳图谱表现为清蛋白降低，α₂和β球蛋白升高；肝硬化型电泳图谱表现为清蛋白降低，β和γ球蛋白增高，可能出现β与γ球蛋白难以分离的“β-γ桥”现象；急性反应时相型电泳图谱常以α₁、α₂球蛋白增高为特征；慢性炎症型电泳图谱则以清蛋白降低，α₂、γ球蛋白增高较为常见。

六、注意事项

1.薄膜的选择：应选择无空泡、皱折、厚薄不匀或霉点变质的醋酸纤维薄膜。

2.缓冲液的浓度：缓冲液的浓度对电泳结果有显著影响，应根据实验条件选择合适的浓度。

3.点样量：点样量应适宜，过多或过少都会影响电泳图谱的清晰度。

4.电泳条件：电泳时的电压、电流和时间应根据实验条件进行优化，以获得最佳的电泳效果。

5.防止溶血：样品应防止溶血，以免影响电泳结果。