一、蛋白质提取

蛋白质提取的原理是通过细胞破碎和分离蛋白质与其他细胞成分的方法，从而得到纯净的蛋白质。提取蛋白质是利用蛋白质的物理和化学性质进行分离和提取。蛋白质的物理性质包括分子量、电荷、溶解性等，化学性质包括氨基酸序列、亲水性、亲油性等。在细菌中，蛋白质提取的常用方法包括机械法裂解、化学法和酶法裂解。

1. 机械法裂解

机械法裂解是通过物理手段破坏细胞膜，释放细胞内的蛋白质。常用的机械方法包括超声波法、高压匀浆法、高速珠磨法等。

超声波法：利用超声波产生的高频振动，使细胞内的蛋白质释放出来。操作简便，适用于小规模实验。例如，可以使用300瓦的超声破碎仪，以10秒超声/10秒间隔的方式，超声处理20分钟，反复冻融超声3次至菌液变清或变色。

高压匀浆法：利用高压将细胞破碎，适用于大规模生产。通过调节压力，可以控制细胞破碎的程度。

高速珠磨法：利用高速旋转的珠子撞击细胞，使其破碎。适用于处理较硬的细胞壁或含有大量纤维素的样品。

在选择细胞的破碎方法时，需要考虑破碎的目的和破碎对象的类型。如果为了定量获得细胞内蛋白质以进一步研究，破碎收率就很重要。细胞的类型、大小、形态、生长条件、细胞壁结构及环境温度、pH等因素都会造成细胞对不同破碎方法的敏感度也不同。可以根据实验及以往的经验来选择破碎方法，但要注意破碎不能影响到目的蛋白产物的活性，在细胞的破碎过程中尽量避免将产物暴露在不利的条件下。破碎过程中，常常产生比较多的热量，需要预先冷却样品（最好到4℃），在破碎过程中，应尽可能保持低温。另外，一旦细胞被破碎，就失去了代谢调节机制的控制，目的蛋白就会受蛋白酶的作用，因此需要迅速提取目的蛋白，或加入抑制剂，或降温以减小蛋白酶的作用。

2. 化学法和酶法裂解

化学法和酶法裂解是通过化学试剂或酶的作用破坏细胞膜和细胞壁，释放细胞内的蛋白质。

化学法：使用去污剂、酸、碱等化学试剂破坏细胞膜。例如，可以使用Triton X-100等去污剂，破坏细胞膜结构，使蛋白质释放出来。但需注意，化学法可能对蛋白质造成损伤，影响其活性。

酶法：利用酶（如溶菌酶、蛋白酶等）特异性地破坏细胞膜和细胞壁。例如，溶菌酶可以水解细菌细胞壁中的肽聚糖，使细胞破裂，释放蛋白质。酶法处理微生物细胞使之裂解并降低裂解物的黏度，具有水解酶对目标细胞的细胞壁成分具有高度特异性、作用温和、不产生剪切力、不会导致高温或氧化等作用的破坏、操作过程中不需要特殊的专用器械等优点。酶法处理细胞、提取蛋白质可以与机械裂解法相结合来提高目标蛋白质释放的选择性，提高提取物的产量和获取速率，减小对产品的损伤，降低黏度以利于下游操作。

3. 具体操作步骤（以大肠杆菌为例）

培养细菌：从含有质粒的转化菌落中挑选单菌落，接种至3毫升选择性LB液体培养基中，37°C、250rpm振摇过夜。次日，将500微升过夜菌液接种至10毫升（1:20）选择性LB液体培养基中，37°C、250rpm振摇至OD600=0.6。

诱导蛋白质表达：加入1摩尔/升IPTG至终浓度1毫摩尔，继续振摇4~5小时。收集诱导前后的菌体沉淀，-20°C冻存备用。

细胞破碎：将诱导培养后的菌体重悬于裂解液1中，-80°C低温冰箱放置10分钟。冰中解冻后，用超声破碎仪破菌6次，每次10秒，间歇10秒，电压200~300伏。

离心分离：10000克、4°C离心20分钟，取上清（溶液A）和沉淀（溶液B），-20°C保存。将A、B溶液和诱导前后的细菌进行SDS-PAGE电泳，考马斯亮蓝染色，比较分析重组蛋白质的溶解性。

二、蛋白质纯化

蛋白质纯化是在提取得到粗蛋白的基础上，通过一系列的方法去除杂质，得到高纯度的目标蛋白质。纯化方法的选择取决于蛋白质的性质、纯度要求和实验条件。

1. 亲和层析

亲和层析是利用蛋白质与特定配基之间的特异性相互作用进行分离纯化的方法。常用的亲和层析包括镍柱亲和层析、谷胱甘肽树脂亲和层析等。

镍柱亲和层析：适用于带有His标签的重组蛋白质。在诱导表达时，将目的基因与His标签融合表达，纯化时，带有His标签的蛋白质可以与镍柱上的镍离子特异性结合，通过洗涤去除杂质，再用咪唑等竞争性洗脱剂将目标蛋白质洗脱下来。

谷胱甘肽树脂亲和层析：适用于带有GST标签的重组蛋白质。GST标签与谷胱甘肽树脂有特异性结合作用，可以用于蛋白质的纯化。

2. 离子交换层析

离子交换层析是利用蛋白质与离子交换树脂之间的静电相互作用进行分离纯化的方法。根据蛋白质的等电点不同，可以选择阳离子交换树脂或阴离子交换树脂进行纯化。在纯化过程中，通过调节溶液的pH值和离子强度，使目标蛋白质与树脂结合或洗脱下来。

3. 分子筛层析

分子筛层析（凝胶过滤）是利用蛋白质分子大小不同进行分离纯化的方法。分子筛层析柱中填充有不同孔径的凝胶颗粒，蛋白质分子在柱中根据分子大小被分离成不同的组分。大分子蛋白质先被洗脱出来，小分子蛋白质后被洗脱出来。

4. 具体操作步骤（以镍柱亲和层析为例）

样品处理：将离心得到的上清液（溶液A）用0.45微米的滤膜过滤，去除杂质和细胞碎片。

平衡柱子：将镍柱用平衡缓冲液（如含20毫摩尔咪唑的PBS缓冲液）进行平衡，直至流出液的pH值和电导率稳定。

上样：将处理好的样品上样到镍柱上，让目标蛋白质与镍离子结合。

洗涤：用洗涤缓冲液（如含50毫摩尔咪唑的PBS缓冲液）洗涤柱子，去除未结合的杂蛋白。

洗脱：用洗脱缓冲液（如含250毫摩尔咪唑的PBS缓冲液）洗脱目标蛋白质，收集洗脱液。

透析或浓缩：将洗脱液进行透析或浓缩处理，去除咪唑等小分子物质，得到高纯度的目标蛋白质。

三、注意事项

1.保持低温：在蛋白质提取和纯化过程中，应尽可能保持低温（4°C左右），以防止蛋白质变性失活。

2.使用蛋白酶抑制剂：在细胞破碎和纯化过程中，可以加入蛋白酶抑制剂（如PMSF、EDTA等），防止蛋白质被蛋白酶降解。

3.选择合适的缓冲液：根据蛋白质的性质选择合适的缓冲液，保持蛋白质的稳定性和活性。

4.控制pH值和离子强度：在纯化过程中，通过调节溶液的pH值和离子强度，优化蛋白质的分离效果。