一、微生物的分离纯化

微生物的分离纯化是研究微生物的基本方法，目的是从混杂的微生物群体中，将特定的微生物个体分离出来，并获得纯培养物。纯培养物是指所有细胞均来自同一祖先的微生物群体，是微生物学研究的基础。

1. 分离纯化的方法

稀释法：在液体中或在固体表面上高度稀释微生物群体，使单位体积或单位面积仅存留一个单细胞，并使此单细胞增殖为一个新的群体。稀释法常与其他方法结合使用，以提高分离效率。

选择培养法：根据待分离微生物对营养、pH、氧气等要求的不同，供给它们适宜的生活条件，或加入某种抑制剂造成只利于该菌种生长，不利于其他菌种生长的环境，从而淘汰不需要的菌种。

平板划线法：用无菌的接种环取少量培养物在固体培养基表面进行划线，通过连续划线使菌液逐渐稀释，最后在所划的线上分散着单个细胞，经培养后每一个细胞长成一个菌落。常用的划线方法有斜线法、曲线法、方格法、放射法、四格法等。

倾注平板法：将微生物悬液通过一系列稀释后，取一定量的稀释液与熔化好的营养琼脂培养基充分混合，然后倾注到无菌的培养皿中，待凝固后倒置培养。单一细胞经过多次增殖后形成一个菌落，取单个菌落制成悬液，重复上述步骤数次，便可得到纯培养物。

涂布平板法：将微生物悬液通过适当的稀释后，取一定量的稀释液放在无菌的已经凝固的营养琼脂平板上，然后用无菌的涂布棒将稀释液均匀地涂布在培养基表面上，经恒温培养后得到单个菌落。

富集培养法：创造特定条件只让所需的微生物生长，从而增加其在群体中的比例，便于后续的分离纯化。

单细胞（或单孢子）分离法：利用显微操作器从混杂群体中直接分离单个细胞或单个孢子进行培养，以获得纯培养物。

2. 分离纯化的步骤

样品采集：根据研究目的采集合适的样品，如土壤、水样、食品等。

样品处理：对样品进行适当的处理，如研磨、振荡、过滤等，使微生物细胞分散成单个细胞。

稀释：将处理后的样品进行梯度稀释，以获得合适浓度的微生物悬液。

接种：采用适当的方法（如平板划线法、倾注平板法、涂布平板法等）将稀释后的微生物悬液接种到固体培养基上。

培养：将接种后的培养基置于适宜的温度、湿度和气体条件下进行培养，使单个细胞增殖形成菌落。

挑取单菌落：在培养基上挑取形态、大小、颜色等特征一致的单菌落，进一步纯化培养，直至获得纯培养物。

二、稀释平板菌落计数

稀释平板菌落计数是一种常用的微生物计数方法，通过统计固体培养基上形成的菌落数量，可以估算出样品中的微生物数量。

1. 原理

稀释平板菌落计数基于微生物在固体培养基上形成的单个菌落是由一个单细胞繁殖而成的原理。通过稀释样品，使每个菌落来源于一个单细胞，从而通过计数菌落数来估算样品中的微生物数量。

2. 步骤

样品稀释：将待测样品制成均匀的系列稀释液，稀释倍数根据样品中微生物的预计数量确定。

接种：取一定量的稀释液接种到固体培养基上，可以采用混合平板培养法或涂抹平板培养法。

培养：将接种后的培养基置于适宜的温度下培养，使微生物细胞增殖形成菌落。

计数：培养结束后，统计培养基上的菌落数量。一般选择菌落数在30~300之间的平板进行计数，以保证结果的准确性。

计算：根据稀释倍数和接种量计算样品中的微生物数量。计算公式为：每克（或毫升）样品中的菌株数 =（C÷V）×M，其中C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数，V代表涂布平板时所用的稀释液的体积（毫升），M代表稀释倍数。

3. 注意事项

无菌操作：整个实验过程必须在无菌条件下进行，以防止杂菌污染。

稀释倍数：稀释倍数应根据样品中微生物的预计数量合理确定，以避免菌落过多或过少影响计数准确性。

重复实验：每个稀释度应设置多个重复平板，以提高计数结果的可靠性。

培养条件：培养条件应根据待测微生物的特性合理确定，以保证微生物的正常生长和繁殖。

计数误差：由于微生物在样品中可能形成聚集体或死亡细胞，因此计数结果可能存在一定的误差。为了减小误差，可以采用多种方法综合计数，如同时使用平板划线法和涂布平板法。

三、应用

微生物的分离纯化及稀释平板菌落计数在微生物学研究中具有广泛的应用。它们可以用于鉴定和分类微生物、检测食品和水源中的微生物污染、评估生物制品的质量和安全性等方面。通过这两种技术的结合使用，可以更加准确地了解微生物的数量和种类，为微生物学研究和应用提供有力的支持。