一、解冻并稀释基质胶

提前2小时将基质胶从-20°C转移到4°C进行解冻处理。将DMEM中添加10%的FBS，并与基质胶原液以1:1的比例稀释混合。操作时请放置在冰盒上进行。

二、铺基质胶至板

当进行显微镜观察时，为了获得更好的对焦效果和形成完整的管道结构，我们需要确保载玻片表面是平整的。在进行载玻片预冷的步骤时（注意在冰盒上进行操作），以ibidi公司的μ slide血管生成载玻片为例：首先在孔内加入10μL基质胶，并避免产生气泡，观察载玻片表面是否存在凹凸或透镜效应。接着将处理好的载玻片放入湿盒中，在37°C的孵箱中放置30分钟至1小时，待基质胶充分成胶后，即可进行下一步实验操作。

在实验中，我们常常使用96孔板、48孔板和24孔板，尽管它们在实验中起到重要作用，但也存在一个缺点，即费用昂贵。因此，我们需要根据实验条件灵活调整使用。与之相比，μ-slide的板子每个价格约为300元，虽然仅具有15个孔，但经过洗净和紫外照射后可重复使用1-5次，这样不仅能省钱，还能实现资源的有效利用。

三、HUVEC消化、计数、铺板

保证控制合适的细胞数量至关重要！在进行实验时，首先将HUVEC细胞经胰酶消化，并用含有10% FBS的DMEM 悬浮细胞。在进行三次细胞计数后，取平均值以确保准确性。以μ-slide血管生成载玻片为例，在每个孔中快速铺设10000-14000个细胞/50μL的细胞悬液后，将载玻片置于37°C孵箱水平面等待4小时。

根据实验具体使用的板,按细胞密度梯度调整确定细胞量,以获得可重复的结果。

四、观察拍照、统计分析

在HUVEC细胞系种植到基质胶后仅经过4小时即可进行拍照。分析可借助Image J软件中的AngiogenesisAnalyzer插件或ibidi公司的ACAS图片分析系统实现。

五、常见失败原因

① 基质胶过期或质量不佳可能对实验结果产生影响。例如，稀释后的基质胶在-20℃保存超过半年会失去活性，这可能导致对HUVEC形成管的抑制作用。因此，在进行实验时，务必确保使用新鲜且质量良好的基质胶，避免使用过期或保存时间过长的样品。

② 基质胶稀释方式不合理。我使用的是abw牌子的基质胶，货号0827045。如果按照1:1的比例用纯DMEM稀释，无法形成管状结构，因此需要采用DMEM中加入10% FBS进行稀释。

③ 当涉及到HUVEC细胞的衰老问题时，需要注意到传代次数过多的HUVEC细胞存在管能力较差的情况，更不用说可能出现细胞污染的情况了。在处理这类情况时需要密切关注细胞传代次数和细胞培养环境的质量。

④HUVEC细胞密度过低是最常见的问题之一。在将HUVEC细胞铺在基质胶上时，必须确保细胞密度达到一定水平，否则无法形成管状结构。每个孔规定10000个细胞/50μL，我以这个基础每2000个细胞地递增。每个人细胞计数都会有自己的习惯带来的误差，所以一定要亲自试，别人提供的数值只是一个参考！建议预实验设一个密度梯度，5000-20000个细胞往上递增。

⑤HUVEC细胞悬液不含血清：我使用的是DMEM+10%FBS。稀释基质胶和重悬HUVEC均使用含血清的培基。

⑥基质胶铺不平，隆起或凹陷。
建议在调整好枪的刻度后，一次性将基质胶铺垫均匀，尽量避免中途加或减材料，同时应在冰上进行操作以减缓凝固速度。在37℃放置固化时，务必确保放置在水平平面上，以确保实验的准确性和稳定性。