一、石蜡组织切片的免疫组化方法

1、需要在玻片上做好详细的记录，并将玻片放入玻片架中，然后将玻片架放入预热至60-65℃的烤箱中，烘烤时间为1至1.5小时。

2、脱蜡水化:二甲苯1,10min→二甲苯2,10min→二甲苯3,5min→无水乙醇1,5min→无水乙醇2,5min→95%乙醇,5min→85%乙醇,5min→蒸馏水清洗。

3、抗原修复:在微波炉里加热0.01M枸橼酸钠缓冲溶液(pH6.0)至沸腾后将玻片放入,维持在近沸腾的温度(95-99℃)10分钟,自然冷却切片在PRST中浸泡5min*2→0.5%TritonX-100室温10min(透膜)→切片在PRST中浸泡5 min*3

4、去除内源性过氧化物酶;3%H2O2室温10min→切片在PRST中浸泡5min*3

5、封闭:取出组织切片，然后使用滤纸吸去切片上多余的水分。接着，用免疫组化笔将组织周围画出一个圈来，确保首尾闭合，并且不要在组织表面画线，以免抗体外溢。随后，小心地滴加封闭液覆盖整个组织，在室温下反应30至60分钟。此步骤的目的是封闭组织，防止后续步骤中的抗体流失。

6、孵抗体:倾去封闭液,勿洗,一抗稀释液4℃过夜→取出切片室温复温Ih,切片在PRST中浸泡5min*3→孵二抗,37°C或室温30min→切片在PRST中浸泡5min*3→辣根酶标记链霉亲和素,37°C或室温30min→切片在PRST中浸泡5 min*3

7、DBA显色:擦干切片上残留液体,滴加DBA显色液,静置显色2min(镜下观察)→自来水流水冲洗3min

8、复染：苏木素复梁30s-3min→自来水流水冲洗3min

9、脱水:85%乙醇,2min→95%乙醇,2min→无水乙醇1,2min→无水乙醇2,4min→二甲苯透明1-2min。

10、封片:将切片取出,滴一滴中性树胶至组织切片中央取一块盖玻片,将盖玻片一端放置于切片上,然后缓慢将盖玻片放下,并覆盖所有组织,避免气泡产生→将切片放于切片板,通风橱内晾干。

二、石蜡组织切片的免疫荧光方法(前面两个步骤相同)

1、抗原修复:组织切片放置于盛满EDTA抗原修复缓冲液（pH9.0）的修复盒中，然后将修复盒放入微波炉中进行抗原修复过程。调节微波炉至中火直至沸腾，然后断电并间隔10分钟，再将微波炉调至中低火持续加热至沸腾。在整个过程中要注意防止缓冲液过度蒸发，以免导致切片干燥。

待样本自然冷却后，将玻片转移到含PBS（pH7.4）的洗涤盘中，在脱色摇床上进行3次洗涤，每次持续5分钟。需要根据具体组织类型和实验要求来确定适合的修复液和修复条件。

2、BSA封闭:将切片稍微抖动晾干后，使用组织化学笔在组织周围勾画一个圆圈，这有助于防止抗体流失。接着，在圆圈内滴加3% BSA，确保组织被均匀覆盖，并在室温下封闭处理30分钟。

3、孵一抗:轻轻甩掉封闭液,在切片上滴加PBS按一定比例配好的一抗,切片平放于湿盒内4”℃昭育过夜。(湿备内加少量水防止抗体蒸发)

4、孵二抗:玻片置于PBS(PH7.4)中洗3次,每次5min。切片稍甩干后在圈内滴加与一抗相应种属的二抗覆盖组织,避光室温嚼育50min。

5、DAPI复染细胞核：玻片置于PBS(PH7.4)中洗3次,每次5min。切片稍甩干后在圈内滴加DAPI染液,避光室温嚼育10min。

6、封片：玻片置于PBS(PH7.4)中洗3次,每次5min。切片稍甩干后用抗荧光淬灭封片剂封片。

7、拍照:拍照步骤中，应当首先将样本切片，并置于倒置荧光显微镜下进行观察。在此过程中，需要使用特定的光谱范围来激发不同荧光染料，从而获取清晰的图像资料。具体参数为紫外激发波长为330-380nm，发射波长为420nm；FITC绿光染料的激发波长为465-495nm，发射波长为515-555nm；CY3红光染料的激发波长为510-560nm，发射波长为590nm。这样可确保在获取图像时获得最佳的成像效果，同时保证实验数据的准确性。
 

三、石蜡组织切片的HE染色方法(前面两个步骤相同)

1、HE染色:苏木素染色0.5~2min→流水冲洗3min→在盐酸乙醇中蘸一下→流水冲洗3min→1%氨水水溶液返蓝数秒,流水冲洗3min→伊红染色数秒,流水中洗3min

2、脱水:85%乙醇,2min→95%乙醇,2min→无水乙醇1,2min→无水乙醇2,4min(以上脱水要快,否则伊红梁色变淡)→二甲苯(1)10min→二甲苯(2)10min

3、封片:过程中使用中性树胶封片，存放于室温下进行干燥保存。在进行HE染色后，观察到细胞质呈现粉红色，细胞核呈现蓝紫色，结缔组织、肌肉和血管分别呈现粉红色和深红色。细胞着色清晰，颜色鲜艳，细胞形态清晰，且细胞之间的界线清晰可辨。整体切片呈现出优质的染色效果。

四、注意事项
1.苏木素和伊红是常用的细胞染色荧光剂，用于显微镜下观察细胞结构。为了获得清晰的染色效果，我们可以进行一些微调和优化。一方面，可以增加苏木素染色时间，以加深细胞核的蓝色；另一方面，延长伊红的染色时间，以增强细胞质的红色。此外，可以缩短洗涤过程中的时间，以避免颜色的混合。同时，在酒精透明化的步骤中，也可以适当缩短乙醇浸泡的时间，以提高对比度和清晰度。通过这些调整，可以获得更加鲜明和清晰的细胞染色结果。
2.在显微镜下进行初步观察。如果染色效果不佳，建议进行重新染色。
3.每个步骤的染色时间不同的情况，因此需要对染色的时间进行仔细摸索，以选择最佳的时间。确定每个步骤的最佳染色时间是确保实验顺利进行并取得可靠结果的关键步骤之一。通过反复尝试和调整，我们可以逐渐找到适合每个步骤的染色最佳时间点，从而提高实验的效率和准确性。