重组蛋白以上清可溶性状态表达，细菌破碎裂解以后可以通过其融合标签进行特异性纯化，目前常用的标签纯化方法有6His标签亲和纯化，GST标签亲和纯化（谷胱甘肽），MBP标签亲和纯化和Strep II标签蛋白亲和纯化等，这些纯化方法都已经非常成熟，由于蛋白质自身理化性质不同，因此在纯化过程中所遇到的问题也不尽相同，最为突出的问题就是标签蛋白不挂柱（或不易洗脱）和纯化蛋白杂带多；并不是按照标准说明就可以得到高纯蛋白的；遇到这些问题除了求助于厂家的技术支持外，还需要:

1.仔细排除实验中操作失误以及不合格试剂带来的影响。

2.在此基础上进一步优化纯化条件，比如，纯化蛋白杂带多，可以尝试不同条件和不同洗脱浓度的梯度洗脱，收集不同的组分以找到最优的纯化条件，具体内容可参照后文中“His和GST标签蛋白纯化问题分析与解决”内容。

3.尝试不同的纯化介质，比如：如果Ni-NTA纯化杂带太多可以尝试Co –NTA或Zn-NTA。

 

SOP5 Ni-NTA层析柱亲和纯化6His标签融合蛋白

样品制备

样品制备1: 细菌或酵母胞内表达的蛋白

（1）将诱导表达结束后的培养物转移到离心管中，８,000rpm，离心15min收集菌体，然后加入1/10体积的裂解缓冲液（50 mM NaH2PO4，300 mM NaCl，10 mM imidazole ，pH 8.0，1mM PMSF) ，加入0.2～0.4mg/ml溶菌酶。

PMSF很容易降解,在破菌前加入,同时还可加入不影响目的蛋白与树脂结合的蛋白酶抑制剂。

（2）将菌体沉淀悬浮起来，（如果菌液浓度高，也可考虑加入10μg/ml RNase A和5μg/ml DNase I），混匀，放置于冰上，然后冰上超声破碎细胞，至菌液基本保持澄清。

（3）将澄清的破碎液转移至离心管中，10,000rpm下，4离心20～30min，取上清，置于冰上备用或-20保存。

样品制备２：酵母、昆虫和哺乳细胞分泌表达可溶性蛋白

将诱导表达结束的培养物转移到离心管中，８,000rpm，离心15min，收集上清。

如上清中不含EDTA、组氨酸和还原剂等物质，即可直接上柱使用；

如含有EDTA、组氨酸和还原剂等物质，需先用PBS 4下透析才可上柱；

大量体积的上清，需加入(NH4)2SO4沉淀浓缩，再用PBS 4透析后再上柱子。

 

样品纯化

Ni-NTA亲和树脂灌装层析柱或直接使用预装柱，层析柱下端接核酸蛋白检测仪。

所有溶液/样品液使用前建议离心或用0.22μm 或0.45μm滤膜过滤后再上柱。

1)用3～5倍柱床体积的去离子水冲洗掉层析柱树脂保护液。

2)使用至少5倍柱床体积的裂解缓冲液平衡层析柱。

3)经过滤的样品液上柱，并收集层析柱下端流出的液体（流穿液）。

利用泵或注射器上样，如果是重力柱也可直接用移液器上样。

4)用洗杂缓冲液（50 mM NaH2PO4，300 mM NaCl，20 mM imidazole，pH 8.0）冲洗柱子，直到核酸蛋白检测仪数值达到一个稳定的基线；至少需要10～15个柱床体积洗杂缓冲液。

在裂解缓冲液和洗杂缓冲液中加入低浓度咪唑（imidazole）可以提高纯化蛋白的纯度。

5)用洗脱液（50 mM NaH2PO4，300 mM NaCl，250 mM imidazole，pH 8.0）采用一步法或线性梯度洗脱液（50 mM NaH2PO4，300 mM NaCl，20～300 mM imidazole，pH 8.0）梯度洗脱。洗脱的过程中顺次分管接收洗脱蛋白并分别做上标记。

一步法洗脱中，通常5倍柱床体积洗脱液可彻底洗脱。

梯度洗脱中，通常需要20倍柱床体积或更多洗脱液分离不同结合强度的蛋白质。

 

SDS-PAGE检测分析纯化过程各组分

纯化过程中得到的样品（包括上样前样品液、流穿液、洗杂液和顺次收集的洗脱蛋白）以及原始样品使用SDS-PAGE检测分析纯化效果。

 

填料再生与保存

组氨酸标签蛋白亲和纯化填料所带的Ni2 不需要经常螯合去除和重新挂Ni2 。当填料使用过程中发现反压过高，填料上面出现明显的污染，或者填料载量明显变低时，需要进行对填料进行Ni2 剥离和重新挂Ni2 ，也就是填料再生。

将填料装填在合适的层析柱内，按照下面操作流程进行Ni2 剥离和重新挂Ni2 。

（1）使用0.2 M 醋酸溶液（含 6 M 盐酸胍）清洗2倍柱床体积。

（2） 使用去离子水清洗5倍柱床体积。

（3） 使用2% SDS 清洗3倍柱床体积。

（4） 使用去离子水清洗5倍柱床体积。

（5） 使用乙醇清洗5倍柱床体积。

（6） 使用去离子水清洗5倍柱床体积。

（7） 使用100 mM EDTA (pH 8.0)清洗5倍柱床体积。

（8） 使用去离子水清洗5倍柱床体积。

（9） 使用100 mM NiSO4清洗5倍柱床体积。

（10） 使用去离子水清洗10倍柱床体积。

填料再生后，可以立即使用，也可以保存在20%的乙醇中，置于4保存。

 

Tips:填料上残留污染物的去除

建议按照下面操作去除填料上残留的污染物，如沉淀蛋白、疏水蛋白和脂蛋白等。

去除强疏水结合的蛋白、脂蛋白和脂类

通过使用30%异丙醇清洗5～10个柱床体积，接触时间为15-20min可以去除此类污染物。然后，再使用10倍柱床体积的去离子水清洗。也可以选择使用含有去污剂的酸性或碱性溶液，2倍柱床体积清洗填料。例如，含有0.1–0.5% 非离子去污剂的0.1 M 醋酸溶液，接触时间为1～2 h。去污剂处理后，需要使用70%的乙醇清洗5个柱床体积，以彻底去除去污剂。最后使用10倍柱床体积的去离子水清洗。

去除离子作用结合的蛋白

使用1.5M NaCl溶液浸泡柱床填料10～15min后，流出浸泡液，再使用去离子水清洗10个柱床体积。

 

问题及解决方案