小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)原代培养可应用于：细胞保种；分子生物学研究；基因治疗相关研究。

操作方法

胰酶消化法

1.原理

将小鼠的胚胎成纤维细胞（MEF）从机体中取出，经胰酶、螯合剂（常用EDTA）处理，分散成单细胞，置MEF生长培养基中培养，使细胞得以生存、生长和繁殖。

2.材料与仪器

孕鼠
PBS EDTA胰酶MEF生长培养基FBS高糖DMEM
眼科直剪眼科直镊眼科弯镊玻璃平皿3尼龙滤网离心管手术刀片

 

步骤

实验材料准备

1.动物

孕期14至16天的孕鼠(小鼠)。

2.试剂

无Ca2+和Mg2+的PBS(D-PBS)、0.05%胰酶、0.53 mmol/L EDTA溶液、MEF生长培养基(高糖DMEM加10%FBS)。

3.器械

眼科直剪3把、眼科直镊3把、眼科弯镊2把、玻璃平皿3套、200目尼龙滤网、50 ml和15 ml离心管和手术刀片。以上物品均需要高压灭菌消毒处理。
 

具体操作
1.处死孕鼠，全身置于75%酒精里浸泡，然后在超净台中用剪刀和镊子将孕鼠皮肤剪开，用另外一组剪刀、镊子剪开腹部肌层，露出子宫，最后用第三组剪刀和镊子将子宫小心取出放在盛有D-PBS的玻璃平皿中，冲洗去血。

2.用两把弯镊子将胚胎外的胞膜小心去除，然后夹掉头和内脏，将其余胚胎转移到一个装有30 ml D-PBS的50 ml离心管中，轻轻颠倒两次，倒掉D-PBS，再重复此步骤一次，注意要留少许D-PBS，然后将胚胎转移到另一装有D-PBS的平皿中，并用手术刀片将其细细切碎。

3.用200 ul的移液枪反复、快速地吹打平皿中的液体，转移至15 ml离心管中，于4℃1500 rpm离心5分钟，倒掉上清，以10 ml胰酶重悬沉淀，放在37℃水浴中消化30分钟，且每隔五分钟轻轻晃动，使之充分消化。

4.将上层细胞悬液倒入一个装有10 ml MEF生长培养基的50 ml离心管中，用200目的尼龙网过滤后，以1 500 rpm离心5分钟收集细胞，再用30 ml MEF生长培养基洗涤两次。

5.细胞沉淀用15 ml MEF生长培养基重悬后进行细胞计数(一般8只14天的胎鼠可获得2-3x107细胞)。

6.3x106细胞悬浮于15 ml MEF生长培养基中，接种到200 ml培养瓶中。

7.24小时后更换新鲜的MEF生长培养基。

8.细胞长满后，先用D-PBS冲洗，倒掉后加胰酶消化(此步时间不宜过长，作者一般不超过五分钟)，按1:5传代。

9.细胞再次长到覆盖率80-90%左右，将其消化后，常规冻存(冻存液要现配)。

小鼠胚胎成纤维细胞(MEF 100倍)

 

注意事项

1.原代培养，一定要避免污染。

2.MEF生存能力有限，如果不冻存，体外存活十代左右。

3.冻存后复苏的细胞只能传代一次，因为这些细胞繁殖能力有限。

4.消化细胞时间不要过长。

 

胰酶消化法

1.原理

将小鼠的成纤维细胞（MEF）从机体中取出，经胰酶、螯合剂（常用EDTA）处理，分散成单细胞，置MEF生长培养基培养基中培养，使细胞得以生存、生长和繁殖。

2.材料与仪器

小鼠
PBS胰酶液氮
镊子平皿剪刀刮胡刀片离心管培养箱离心机移液枪显微镜

 

步骤

取得小鼠胚胎

1.性成熟母小鼠与种公鼠按1公（♂）:2母（♀）比例合笼。

2.每天早上观察母小鼠阴道口。有乳白色或蛋黄色冻胶状物(阴道栓)即确定为怀孕。见栓当天上午定为怀孕的0.5d。

3.取怀孕12.5～14.5 d母鼠，断颈处死，无菌条件下暴露子宫。
4.用镊子提起近子宫颈端，分离子宫系膜，剪断子宫角。

5.取出整个子宫，置于有PBS的平皿内。用PBS洗涤三次，弃除表面残余血迹。

6.沿子宫系膜侧剪开子宫，取出带有胎膜的胚胎，置于另一盛有PBS的平皿内，充分洗涤，弃除表面红细胞。

7.用小镊子撕破胎膜，取出胎鼠，弃除胎膜，用PBS洗涤三次。

8.去除胚胎头部、内脏和四肢，将躯干部置于另一盛有PBS的平皿内，用PBS至少洗涤三次，充分弃除红细胞。

取得小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）

1.用无菌眼科小剪刀或刮胡刀片将鼠胚躯干剪(切)成1mm3以下的碎块，吸置于离心管内。

2.加适量胰酶，将离心管置于培养箱中10-20分钟

3.取出离心管，反复吹打，加足量培养液终止消化。

4.离心1000转，5分钟。

5.弃掉上清，加适量培养液，反复吹打20次。

6.分装到T75中，一般每2个胚胎可以制成一个T75的原代细胞。

7.置37℃、5%CO2、饱和湿度培养箱培养。

8.待细胞长3-7天细胞互相重叠爬满整个培养瓶底时即可1：3-1：6传代。

9.吸弃培养液上清。

10.PBS（不含钙镁）冲洗两次。

11.加0.25%胰酶-0.02EDT消化。

12.在显微镜下观察，当少量细胞漂浮，贴壁的细胞层出现裂隙时，用移液管吹打冲洗瓶底5-6次。

13.即刻加MEF培养液终止消化。

14.1000转，5分钟离心。吸弃上清。

15.加足培养液，吹打制成单细胞悬液，分装到各T75中。完成传代。

16.原代细胞中还有少量组织块未被充分消化，在以后的每次传代过程中要尽量制成单细胞悬液，组织块会逐渐消失。

17.原代细胞中混有一些杂细胞，一般传到第3代时，杂细胞逐渐减少。小鼠胚胎成纤维细胞为梭状；但连成片时，细胞互相交联，形态不典型。

 

MEF的冻存

1.当细胞90%-100%融合时，尤其细胞少量堆聚可冷冻。

2.处理方法同二的9-14，每75 cm2的细胞加3 ml冻存液重悬细胞。

3.每个冻存管编号加1 ml细胞悬液。

4.置入程序降温盒-80℃过夜，放入液氮长期保存。

 

灭活MEF制备饲养层细胞

1.取新的培养瓶，加0.1%Gelatin溶液覆盖预处理30分钟，用前吸掉Gelatin溶液。

2.取需要处理的MEF细胞，以10ug/ml浓度加丝裂霉素（Mitomycin C）混匀。

3.置培养箱中3小时。

4.吸弃废液。

5.用DPBS洗5遍。

6.处理方法同二11-14。

7.处理过的MEF加适量培养液重悬计数，以3.0x104/cm2（MEF）铺在Gelatin处理过的培养瓶上。

8.置培养箱中静置过夜，使其贴壁。

9.铺好的饲养层在1-7天内有效，都可以支持mES生长并维持其全能性