产品简介

细菌/酵母活力染色试剂盒（SYTO-9/PI荧光法）是一款利用SYTO 9绿色核酸染料和碘化丙啶（PI）红色荧光核酸染料进行活、死细菌染色的试剂盒，可使用酶标仪，流式细胞仪以及荧光显微镜等荧光分析仪器进行分析。适用于各种革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌，包括大肠杆菌，枯草芽孢杆菌，溶壁微球菌等。另，本试剂盒也可用于酵母菌的活力染色。

该试剂盒含有SYTO-9和碘化丙啶（PI）两种荧光染料，其中SYTO-9是一种绿色核酸荧光染料，可染色膜完整的细菌和膜受损细菌；碘化丙啶（PI）是一种红色核酸荧光染料，仅染色膜受损的死细菌，而碘化丙啶（PI）的插入会引起SYTO-9染色荧光的降低。当细菌悬液中同时加入两种染料时，适当调整SYTO-9和碘化丙啶（PI）的比例，可使具有完整膜结构的细菌呈绿色荧光，而具受损膜结构的细菌呈红色荧光。两者染料与核酸结合后最大激发和发射波长分别是485/530 nm（SYTO-9）和485/630 nm（PI）。

细菌的生存活力，即在适合的培养物中细菌的繁殖能力。在一些条件下膜受损的细菌依旧可以繁殖，但在检测过程中会被判定为死细菌；而一些膜结构完整的细菌虽被判定为活细菌，却没有繁殖力。因此，如果该检测与生长测定之间存在较大差距时，应考虑以上原因。

按推荐的用法用量，如果用流式细胞仪检测：每500 μL菌液加入1 μL染料混合液（1 μL SYTO-9 +1 μL PI），可做40次独立实验。如果采用荧光酶标仪检测或荧光显微镜检测：每100 μL菌液加入1 μL染料稀释液（1 μL SYTO-9 +1 μL PI+8 μL 0.85% NaCl），可做200次独立实验。

使用说明：
操作步骤
【注意】：本试剂盒进行细菌染色，核酸和其它培养基成分可能会以不可预估的方式与 SYTO-9 和 PI 结合，导致染色结果与预期差别较大，故务必去除培养基残留，同时磷酸盐缓冲液也可能降低染色效率，推荐选用0.85% Nacl 溶液。在实验过程中，如果发现绿光染色效率过低，或者红光过高，可以通过适量提高绿色染料的体积或者降低红色染料的体积调整荧光强度达到预期效果。

一、活细菌/死细菌制备（以大肠杆菌为例，细菌活死比例参考，选做）
(1) 在 LB 液体培养基中将大肠杆菌培养至晚期对数期。
(2) 用 EP 管将菌液分成 2 份，将其中一份 8000 g 条件下离心 10 min（另一份室温放置用来制备活细菌）。
(3) 去除上清液，加入适量的 0.85% Nacl 重悬细菌，再加入适量无水乙醇使乙醇的终浓度为 70%乙醇，充分混匀，室温下孵育 1 h，每 15 min 混合一次，用于制备死细菌。
(4) 将 2 份菌液在 8000g 条件下离心 10 min。
(5) 去除上清，在两种样品中加入适量的 0.85% NaCl 重悬细菌，并如步骤 4 再次离心，并重悬.
(6) 使用分光光度计测定两种菌悬液在 670 nm 处的吸光值（OD670）。
(7) 调整两种菌悬液（活的和死亡的）的光密度使其 OD670 在 0.03-0.1 之间。
(8) 如下所示混合两种菌悬液以获得所需的活细胞：死细胞比率。

二、荧光显微镜操作步骤
(1) 细菌 8000 g 条件下离心 10 min，去除上清，加入适量的 0.85% NaCl 重悬细菌，重复离心一次，重悬于适量 0.85% NaCl。。
(2) 调整细菌光密度，如大肠杆菌，OD670 在 0.03-0.1 之间。
(3) 将 1 体积的 SYTO-9 和 1 体积的 PI 在微量离心管中混合，充分混合后加入 8 体积的 0.85% NaCl 溶液以得到 100×染料混合溶液。
(4) 每 100 μL 菌悬液，加 1 μL 的 100×染料混合溶液。
(5) 充分混合，室温避光孵育 15 min。
(6) 取 5 μL 染色后的菌悬液滴在载玻片上，再用 18 mm 方形盖玻片轻轻盖上。
(7) 在荧光显微镜下观察。活细菌（绿色荧光）和死细菌（红色荧光）可分别用 FITC 和 Cy3 通道观察拍照。

三、荧光酶标仪操作步
(1) 细菌 8000 g 条件下离心 10 min，去除上清，加入适量的 0.85% NaCl 重悬细菌，重复离心一次，重悬于适量 0.85% NaCl。
(2) 调整细菌光密度，如大肠杆菌，OD670 在 0.03-0.1 之间。
(3) 将 1 体积的 SYTO-9 和 1 体积的 PI 在微量离心管中混合，加入 8 体积的 0.85% NaCl 溶液，充分混合以得到 100×染料混合液。
(4) 取 100 μL 细菌悬液到黑色平底 96 孔板，每 100 μL 菌液加入 1 μL 染料混合液。
(5) 充分混合，室温避光孵育 15 min。
(6) 荧光测定和数据分析
1 以~485nm 为激发波长，~530nm 为发射波长（emission 1，绿色）来测定每孔荧光
2 以~485nm 为激发波长，~630nm 为发射波长（emission 2，红色）来测定每孔荧光；
3 通过测定两种发射波长下的荧光强光，并计算荧光比值=emission1/emission2;
4 以大肠杆菌悬液内活细胞的比例为横坐标，以 emission1/emission2 为纵坐标，制线形图。

四、流式细胞仪操作步骤
(1) 细菌 8000 g 条件下离心 10 min，去除上清，加入适量的 0.85% NaCl 重悬细菌，重复离心一次，重悬于适量 0.85% NaCl。
(2) 调整细菌光密度，如大肠杆菌，OD670 在 0.03-0.1 之间。
(3) 将 1 体积的 SYTO-9 和 1 体积的 PI 在微量离心管中混合，加入 8 体积的 0.85% NaCl 溶液，充分混合以得到 100×染料混合液。
(4) 每 500 μL 菌液加入 5 μL 染料混合液。
(5) 充分混合，室温避光孵育 15 min。
(6) 使用流式分析仪分析，SYTO-9 使用 FITC 通道检测 SYTO-9(绿光，活菌)，PI 使用 PE/PC5.5 通道检测 PI(红光，死菌）。

注意事项
1. 由于 SYTO-9 和碘化丙啶（PI）组分较少，务必开盖前先低速离心。
2. 首次使用后可将染料小量分装保存，避免反复冻融和污染。
3. SYTO-9 与 PI 均为 1000×的储存液，经过优化对大多数细菌都适用，但为了获得更满意的结果，对于不同类型的细菌请自行进行一定的浓度摸索，SYTO-9 和 PI 的使用终浓度一般为 0.5-2×，最优先的推荐终浓度为 1×。例如：酵母菌染色时 SYTO-9 推荐 1×，PI 推荐 2×的终浓度。
4. 大肠杆菌建议光密度 OD670 为 0.03-0.1，枯草芽孢杆菌建议光密度 OD670 为 0.01-0.1，溶壁微球菌建议光密度 OD670 为 0.01-0.1，酵母菌建议光密度 OD670 为 0.1-0.3。
5. 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。