一.什么是ELISA?
酶联免疫吸附测定（ELISA）是最常用的标记免疫分析技术之一。
它基于一种酶标记抗体，能够检测固定在96孔或384孔酶标板上的抗原，加入的底物可以产生与原始样品中存在的抗原量相关的颜色变化或光信号。
这是一种简单而快速的技术，用于检测附着在固体表面的抗体或抗原。
ELISA通常用于量化样品中特定目标的水平，常规用于ELISA的样本包括血清、血浆、细胞培养上清液、细胞裂解液、唾液、组织裂解液和尿液。
作为最敏感的免疫分析方法之一，ELISA在实验室研究、疾病生物标志物诊断和各个行业的质量控制方面具有商业价值。
二.ELISA的主要类型?
根据抗原固定策略、抗体标记策略以及抗体-抗原反应类型（直接识别或竞争）的不同。
ELISA可以分为：直接法、间接法、夹心法、竞争法 每种类型的ELISA都有自己的优势和劣势。
1.直接法ELISA
直接法ELISA是最简单的ELISA形式。
抗原通过一段时间的孵化被动地附着在酶标板孔底部。在简单的洗涤步骤后，通过添加与酶共价连接的抗体来检测抗原。
孵化和洗涤后，通过添加色原/底物产生颜色变化。
在一段时间后，或在规定时间通过化学方法停止酶活性后，在分光光度计中读取显色。
由于在直接法中只使用一个抗体，它们的特异性比夹心法低，所以直接法ELISA适用于样品中抗原的定性或定量检测、抗体筛选和表位基因图谱。
这种方法没有交叉反应的二抗，可以在更短的时间内进行检测。
然而，一抗的免疫反应可能会受到酶标记的不利影响。
标记的一抗不常用，因此使用直接法ELISA时，需要为每个特定的ELISA系统标记一抗。
2.间接法ELISA
间接法与直接法相似，抗原被固定在一个板上，但它包括一个额外的扩增检测步骤，间接法ELISA检测是在直接法ELISA的基础上添加一个标记二抗进行检测，是目前最流行的ELISA形式。抗原通过孵化被动地附着在孔上。
洗涤后，抗原与抗原特异性抗体一起孵化。
洗涤后，添加与酶共价连接的抗体，此抗体对第一次添加的抗体所产生的物种具有特异性，可以检测所有结合的抗体。
孵化和洗涤后，可以进行测试和读数。与直接法ELISA类似，间接法ELISA可用于抗体筛选、表位基因图谱和蛋白质定量检测。
二抗的作用是增强一抗的信号，使间接ELISA比直接ELISA更敏感。
然而，它也会产生更高的背景信号，并可能降低整体信号。
3.夹心法ELISA
夹心法ELISA是最有用的免疫测定形式之一，它设计用于检测可溶性抗原。
根据使用的抗体数量，该ELISA有两种形式。
两者的原理是相同的，一种是直接将抗原固定在固相上，另一种是将捕获抗体固定在固相上以捕获抗原。
捕获抗体被附着在固相上。
洗去多余的未结合抗体后，加入的抗原被特异性捕获。
然后用第二种酶标记的抗体直接针对该抗原进行检测。
这种类型的检测适用于有单一物种抗血清可用，且抗原不能很好地附着在板上时。
通过第二种未标记的抗体来检测抗原。该抗体则使用酶标记的偶联物来检测。
重要的是偶联物不能与捕获抗体结合，因此产生捕获抗体的物质必须是不同的。
该方法的优点是，可以使用单一的抗偶联物来检测任意数量样品中抗体的结合。
这种方法适用于抗原被其他蛋白质污染或低浓度时。
在这些情况下，抗原不能以足够高的浓度直接附着在固相上，以使用直接或间接ELISA进行检测。
夹心ELISA依赖于具有至少两个抗原位点的抗原，以便至少两个抗体群可以与之结合。
4.竞争法ELISA
直接法ELISA是最简单的ELISA形式。
抗原通过一段时间的孵化被动地附着在酶标板孔底部。
在简单的洗涤步骤后，通过添加与酶共价连接的抗体来检测抗原。
孵化和洗涤后，通过添加色原/底物产生颜色变化。
在一段时间后，或在规定时间通过化学方法停止酶活性后，在分光光度计中读取显色。
上述系统是ELISA的基本配置。
所有这些都可以适用于使用竞争或抑制条件测量抗原或抗体，随着溶液中游离抗原（抗体）量的增加，将与固定基质结合的抗体（抗原）量会减少。
在洗涤步骤之后，添加发色团底物以产生信号（颜色变化或光）。
抗体/抗原挑战引起的信号变化揭示了竞争性抗原/抗体的信息。
样品中的抗原越多，最终孔底结合的参照抗原的抗体就越少，信号就越弱。
将可能含有抗原的未知样品与含有已知量纯化抗原的类似样品进行比较时，竞争 法ELISA适用于测量复杂混合物中的抗原浓度。
三.ELISA常见问题与解决方法
1.阴性对照出现阳性结果
① 样品、试剂被污染，或加样时操作不当导致相邻孔之间溶液溅洒出现交叉污染——更换试剂，小心操作。
② 酶标板洗涤不彻底——洗板前先将抗体溶液倒干净，然后清洗液倒满板孔，确保能充分洗涤。
③ 抗体量过多导致非特异性结合——根据说明书的推荐量使用抗体，稀释抗体到适当浓度。
2.酶标板整体背景高
① 抗体非特异性结合——应确保板孔进行了封闭并且使用的是恰当的封闭液以防止非特异性结合。
② 底物结合浓度过高——对底物进行适当稀释。
③ 反应时间过长——当酶标板显色足够进行吸光度读数时立即使用终止液终止反应，适当缩短显色时间。
④ 底物溶液污染——正常底物溶液应是澄清透明的，若出现黄色或其他颜色表明受到污染，应更换新的底物溶液。
⑤ 底物孵育过程没有避光——底物孵育应在避光条件下进行。
3.复孔之间重复性差
① 样品数量不整齐，加样时间有长有短——加重复孔时尽量保持加样时间与第一次接近。
② 加样量不一致——样品稀释前应充分混匀，并且使用同一移液枪。
③ 洗涤条件、操作人员不一致——重复测定样品时，操作条件、人员应尽可能与上次保持一致。
4.吸光值偏高或偏低
① 样品中待测抗原含量太低会导致测定结果偏低——可尝试增加样品使用量。
② 加入抗体量不合适会造成结果偏低或偏高——使用建议抗体量或为了使结果更好尽可能调整抗体的最适用量。
③ 孵育时间太短导致检测结果偏低——适当延长抗体或抗原的孵育时间，确保待测样品与检测抗体能充分结合。
④ 孵育温度不适合——应保证抗体在最适宜条件下进行孵育（一般37℃孵育1h）。
