一、什么是蛋白磷酸化？
蛋白质磷酸化是生物界最普遍，也是最重要的一种蛋白质翻译后修饰，20世纪50年代以来一直被生物学家看作是一种动态的生物调节过程。在细胞中，大概有1/3的的蛋白质被认为是通过磷酸化修饰的。
二、磷酸化有什么作用？
蛋白质的磷酸化修饰与多种生物学过程密切相关，如DNA损伤修复、转录调节、信号传导、细胞凋亡的调节等。磷酸化蛋白质及多肽的研究可以帮助人们阐述上述过程的机理，进一步认识生命活动的本质。
三、磷酸化的过程是怎么样的？
磷酸化对蛋白质功能的正常发挥起着重要的调节作用，该过程是由蛋白质激酶（Kinase）催化的把ATP或GTP的γ位磷酸基转移到底物蛋白质的氨基酸残基，如丝氨酸（Serine，Ser，S）、苏氨酸（Threonine，Thr，T）和酪氨酸（Tyrosine，Tyr，Y）等上的过程，而其逆向过程则是由蛋白质磷酸酶去除相应的磷酸基团。正是这两种酶的相反作用及其中所涉及到的能量消耗与生成使磷酸化成为体内很多生理活动调控的首选方式。
四、检测蛋白质是否磷酸化以及磷酸化水平的常用方法？
Western blot是评估蛋白磷酸化状态的最常用方法，利用SDS-PAGE分离蛋白样品，随后转移到印迹膜上，之后利用磷酸化特异性抗体来鉴定目的蛋白。
有人会说western blot还不好做吗？那可是研究生的技能标配，但是磷酸化蛋白的western blot就不能小看了，多少人在这里摸爬滚打，绞尽脑汁。下面让我们一起来学习磷酸化WB和普通WB有什么不一样？
五、检测样本是否表达目的蛋白
实验前需先查阅文献或通过预实验检测该样本是否表达目的磷酸化蛋白，若正常情况下样本的磷酸化水平过低或不表达，可通过物理或化学方法进行一定的刺激和诱导，正确的刺激会帮助得到最佳实验结果。
六、检测总蛋白是否有变化
封检测磷酸化蛋白之外，往往也需要检测总蛋白。仅仅是检测到磷酸化蛋白表达量的升高或降低并不能说明问题，只有磷酸化蛋白与总蛋白比值增加或减少了才能说明磷酸化水平的变化。
七、点样时加入Marker
做磷酸化蛋白Western blot时,除了目标蛋白的条带以外,往往会出现非特异性的条带。如果磷酸化抗体不佳，甚至只有非特异性的条带，而没有目的条带。所以点样时需同时加入合适分子量范围的Marker,根据 Marker进行比对，查看条带的分子量，是否是目的条带。否则有可能会误以为一些非特异条带是目的带，白白耗费了大量精力得出错误的结果。
八、抑制磷酸酶的干扰
由于蛋白的磷酸化是可逆的，会被磷酸酶去磷酸化，所以在样品制备和整个检测过程中，需要抑制或避免细胞内源性和外源性的磷酸酶的干扰。针对细胞内源性的磷酸酶，在样品制备时，需要在裂解液中加入足量的蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂。外源性的磷酸酶主要是由实验过程中的其它试剂带入的，比如要确保实验试剂中不含磷酸酶等；此外，样品中或其它试剂中带的细菌也会分泌外源性的磷酸酶，所以另一个关键是要尽量使用无菌清洁的试剂和凝胶，必要时加入防腐剂。
九、经验分享和磷酸化小Tips
所谓细节决定成败，除了以上注意事项，操作细节尤其重要，稍不注意就会事倍功半，这就是为什么很多小伙伴在做磷酸化蛋白的WB 实验时，很疑惑明明按照步骤操作的，为什么结果还是不理想，所以大家一定要注意以下细节。
Tips1:蛋白提取
1提取蛋白样品的过程要迅速，样品要新鲜，最好在冰上操作，操作时间尽量短。
2用PBS洗涤细胞时，一定要4℃预冷。如果是组织的话，提取蛋白时采用液氮研磨的方法，研磨器具最好提前预冷，保持低温状态。
3提取的磷酸化蛋白蛋白定量后马上变性并于-80℃分装保存，以保证降解程度最小，避免反复冻溶导致磷酸基团的降解。
4磷酸化蛋白容易脱磷酸化，除提取蛋白时要迅速小心外，也可在上样缓冲液和转移缓冲液中加入磷酸化酶抑制剂Na3VO4等。
Tips2:封闭
1避免印迹封闭时间过长，因为这会掩盖抗原表位，阻止抗体结合。
2封闭后在 TBST 中洗涤 5 分钟。
3一抗和二抗均建议用 1*TBST洗印迹 3 次，每次 5-10 min。洗印迹时间不宜过长或过短，过长会导致信号减弱（抗体被洗脱），过短则会导致背景深。洗膜时不要把几张膜叠在一起洗，否则会影响洗膜效果。
Tips3:抗体
1选择好的磷酸化抗体是成功的关键因素。且尽量根据磷酸化抗体公司的protocol来操作实验，这是实验成功的保证。
2抗体的稀释倍数也要适当，可依据实验结果优化调整。孵育磷酸化抗体即一抗后建议4度过夜，保证抗体有充分的结合时间,因为通常磷酸化的蛋白只占总的蛋白量的极少部分。
3二抗孵育室温1小时即可。
Tips4:曝光
1磷酸化蛋白检测时背景往往比较深，所以曝光或压片时间要适当,不能太长或过短，太长则背景太深盖住了目的条带,时间过短则可能没有条带或者条带太浅.。可以选择多个时间进行曝光或压片，选择最佳结果，再优化出适合自己目的蛋白和实验体系的最佳条件。
2一般磷酸化和总蛋白的条带位置基本是一样的，所以可以在显影完磷酸化抗体后，将印迹上已结合的抗体剥离后再孵育总蛋白抗体（需重新封闭）显影。3Strip时一定要注意，印迹膜一定要完全浸泡在含剥离液的容器中，置于40-50℃恒温箱中，使受热均匀，摇床孵育30分钟。抗体剥离液是用来去除已结合的抗体，如果温度过高或时间太长但也会去除部分的蛋白，导致蛋白信号变弱。
