抗生素筛选预实验
抗生素预实验目的是确定抗生素的最佳浓度，同时确定抗生素对所选细胞的最低作用浓度，以便用于病毒感染后通过合适的抗生素浓度进行稳定株构建。
实验步骤（以 Puromycin 筛选为例）
1、细胞培养：取待测培养且状态良好的细胞，制备成细胞悬液，按等量接种入 96 孔培养板中，待细胞生长至70~80%汇合度左右开始加药。
2、加入 Puromycin 药物进行空细胞致死最低浓度筛选，浓度范围一般设置为：1μg/mL、2.5μg/mL、5μg/mL、10μg/mL 等。
*以上为终浓度，具体浓度设计可参考文献中相关细胞常用浓度并设置梯度，一般设置7~8 个浓度点，并做2~3 复孔
3、药物处理 72h 后细胞全部死亡的最低药物浓度，即为后续 Puromycin 抗性细胞的筛选浓度（全致死浓度），可通过不同浓度加药细胞拍摄图片分析，或酶标仪检测 CCK8 数据分析，建立死亡曲线，确定最佳筛选浓度。
常见抗生素类型及浓度范围推荐
嘌呤霉素盐酸盐Puro（首选）
使用浓度 1~10μg/mL作用时间 72 小时
杀稻瘟菌素S Blasticidin S（次选）
使用浓度 5~50μg/mL作用时间 72 小时
遗传霉素G418
使用浓度 100μg/mL~1mg/mL作用时间 10~14 天
潮霉素B Hygromycin B 使用浓度 50-500 μg/mL作用时间 7-10 天
抗生素筛选建立稳转株
带有不同抗性的慢病毒在成功感染细胞后，能使细胞在含有一定浓度对应抗生素的培养基中存活，而未感染上慢病毒的细胞则无法存活。因此在抗性筛选压力下，可成功筛选稳定表达目的基因的细胞株。
如：带有 Puromycin 抗性的慢病毒感染 48~72 小时后（70~80%汇合度），将细胞继续培养于含适当浓度 Puromycin 的培养液中，每 3~4 天更换一次含抗生素的培养液，直至未感染病毒的对照组细胞被抗生素杀光，而感染病毒组再无细胞出现死亡（如病毒载体带有荧光标记，荧光效率需达到 100%）后，进行混合克隆及单克隆稳定株筛选。
注：筛选浓度即为抗生素预实验确定该细胞的全致死浓度，筛选时可设置未感染病毒的野生型细胞作为对照，加入等量浓度抗生素。
