设备：移液枪、载玻片

试剂：多聚甲醛（PFA）、PBS、Triton X-100

一、固定细胞

准备已转染48h后的细胞，用移液枪弃去24孔板中的完全培养基，加入适量4%的多聚甲醛。（适量即使PFA没过每个孔的孔底）

静置20min使细胞固定在爬片上，固定好后，用移液枪将所有的多聚甲醛进行收集，当做废液处理。（多聚甲醛对人体有害，注意收集处理）

24孔板中的每个孔加入500μL PBS、浸泡5min，浸泡好后，弃去每个孔内PBS、继续重复两次PBS润洗的操作。（一共进行三次PBS浸泡润洗，每次浸泡5min）

二、细胞通透

每个孔中加入300μL0.2%的Triton X-100（Triton X-100使细胞更加通透，需要用PBS稀释），将24孔板放入4℃ 的温度中孵育10min（Triton X-100 4℃孵育通透效果更佳）

从冰箱中取出孵育好的细胞，用移液枪弃去24孔板中的Triton X-100 （收集处理废液），每个孔加入500μLPBS（PBS没过底部）

浸泡5min后弃去PBS，继续重复两次PBS浸泡润洗的操作（一共进行三次PBS浸泡润洗，每次浸泡5min）

三、封闭细胞

吸去24孔板中的PBS后，每个孔中加入300μL 10%的山羊血清（山羊血清需用PBS稀释）将24孔板消毒后放入37℃的培养箱中，封闭细胞30min

四、一抗操作

用移液枪吸去24孔板中的10%的山羊血清，每个孔加入200μL的一抗（一抗用5%，山羊血清配制，按抗体说明书的比例稀释）

将24孔板放入4℃的温度中（过夜12-16h，进行孵育）

孵育好后，回收一抗（一抗，-20℃保存，可重复使用1-3次），每个孔用500μL，PBS进行浸泡润洗（需重复操作进行三次PBS浸泡润洗，每次浸泡5min）

五、二抗操作

吸去24孔板中的PBS后，每个孔加入200μL，荧光二抗（二抗带有荧光，为了使细胞进行荧光显现）

PS：本次实验使用的一抗为鼠抗，所以选择的二抗为鼠抗绿光488。本次实验一共10个孔，所以一共需要3mL的二抗。

55%的山羊血清：鼠抗绿光488=200:1，按需配置，每次需多配500μL，不断加液会有消耗

桌面画八字并摇晃混合均匀，将24孔板消毒后放入37℃的培养箱中，孵育1h

六、细胞染核

收集孵育过后的二抗，每个孔中加入500μLDAPI，避光保存10min使细胞核充分染色，10min后弃去孔中的DAPI（实验室有条件的话，可以用荧光显微镜看一下DAPI的亮度，如果较暗，可以再增加DAPI染色时间）

每孔再加入1mLPBS浸泡

七、封片

在载玻片上做好标记（细胞名称、抗体名称、爬片的序号等），用移液枪取10μL，抗荧光淬灭剂，在同一载玻片上左右各加一滴。

将24孔板中的爬片取出（注意轻柔操作，勿将爬片破损），将爬片的细胞面覆盖在一滴抗荧光淬灭剂上（尽量避免气泡），另一滴抗荧光淬灭剂上重复同样操作（同一载玻片上，两滴抗荧光淬灭剂盖有一片爬片，作为同一分组的重复）

用指甲油将爬片沿周覆盖（指甲油可换封片液），使爬片固定在载玻片上，将载玻片放置在阴凉处风干，将玻片放在激光共聚焦进行检测（也可用荧光显微镜观察，拍照）

一抗蛋白表达在细胞膜上与空白细胞组相比，转染组此细胞的一抗蛋白表达明显增加

自此，IF实验完成！