一、针对细胞样本
1、试剂准备，所需试剂临用前预冷，且加入终浓度均为 1mM 的 PMSF 和原钒酸钠。
2、收集细胞 4℃，500g 离心 5min，用0.25M 缓冲蔗糖溶液洗涤数次。然后在 0～4℃ 条件下，按 2x107 细胞加 2mL 的比例加入 0.25M 缓冲蔗糖溶液将细胞匀浆，蔗糖溶液应分数次添加。
3、先将 2mL 的 0.34M 缓冲蔗糖溶液先加至离心管底部，然后沿管壁小心地加入 2mL 匀浆液使其覆盖于上层，700g 离心 10min 分别收集上清和沉淀。
4、将收集的沉淀用 2mL 的 0.25M 蔗糖溶液洗涤 2 次，每次 1000g 离心 15min 收集上清。
5、将上述上清合并 10000g 离心 10min 收集沉淀。
6、将收集到的沉淀加 2mL 的0.25M 蔗糖溶液洗涤 2 次,每次 10000g 离心 15min，收集沉淀。
7、沉淀加入 RIPA 裂解液（1x106 细胞加入 100uL 裂解液），用枪混匀，置于冰上 30min。
8、将裂解蛋白样品于冰上超声破碎，使其裂解更充分，零下 80℃ 保存。
二、针对组织样本
1、试剂准备，所需试剂临用前预冷，且加入终浓度均为1mM 的PMSF和原钒酸钠。
2、取两个干净的平皿，在 0.25M 缓冲蔗糖溶液中洗净组织块上附着的脂肪和血液等杂质。用滤纸吸干水分，称重后放入预冷过的陶瓷研钵中，将其剪碎。然后在 0～4℃ 条件下，按每克组织加 9mL 冷的 0.25M 缓冲蔗糖溶液将组织匀浆化，蔗糖溶液应分数次添加。
3、将 9mL 的 0.34M 缓冲蔗糖溶液先加至离心管底部，然后沿管壁小心地加入 9mL 匀浆液使其覆盖于上层，700g 离心 10min 分别收集上清和沉淀。
4、将收集的沉淀加 10mL 预冷的 0.25M 缓冲蔗糖溶液 2 次，每次 1000g 离心 15min 收集上清。
5、将上述上清合并 10000g 离心 10min 收集沉淀。
6、将收集到的沉淀加 10mL 预冷的 0.25M 蔗糖溶液 2 次，每次 10000g 离心 15min，收集沉淀。
7、沉淀加入 RIPA 裂解液（1x106 细胞加入 100uL 裂解液），用枪混匀，置于冰上 30min。
8、将裂解蛋白样品于冰上超声破碎，使其裂解更充分，零下 80℃ 保存。
