一、体系内部因素

1.引物：长度、扩增跨度、特异性等因素；

2.酶及其浓度：酶浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物量减少；

3.dNTP的质量与浓度：dNTP溶液呈酸性，一般配置成体系需将其调节至7.0-7.5，正常情况下4种dNTP的浓度应该相等，如果其中某一种过高就会引起错配，浓度过低又会引起PCR产物的产量。不过目前使用的都是商品化配置好的预混液体系；

4.模板核酸：模板核酸的量和纯度，是PCR成败与否的关键环节之一，对于RNA模板更要注意RNA的降解；

5.Mg2+浓度：主要影响PCR扩增的特异性和产量，Mg2+浓度过高，反应特异性降低，出现非特异性扩增，浓度过低会降低Taq 酶的活性，使反应产物减少；

6.温度与时间的设置：变性温度与时间、退火温度与时间、延伸温度与时间；

7.循环次数：循环次数决定PCR扩增程度，PCR循环次数主要取决于模板DNA的浓度。一般温度循环次数在30-40次之间，循环次数越多，非特异性产物的量就越多；

 

二、体系外部因素

1.SDS: 离子去污剂，0.01%即可完全抑制PCR反应，0.005%可显著降低产量

2.苯酚: 0.5%即可完全抑制PCR反应，0.2%可显著降低产量

3.乙醇: 大于1%的浓度可抑制PCR反应，但在某些体系里又能增加产量

4.异丙醇: 抑制作用比乙醇稍强

5.乙酸钠: 大于5mM时抑制PCR反应

6.氯化钠: 大于25mM时抑制PCR反应（生理盐水无影响）

7.EDTA: 0.5mM可使PCR产物减少，1mM完全没有PCR产物

8.血红素-来源：血液，大于1mg/ml抑制PCR反应

9.氯高铁血红素：大于0.1ng/μl抑制PCR反应

10.丹宁酸：大于0.1ng/μl抑制PCR反应

11.肝素：大于0.15IU/ml抑制PCR反应

12.尿素-来源：尿，大于20mM时产生抑制

13.腐殖质-来源：土壤，植物材料，自然界水

14.植物多糖-来源：粪便，植物多糖

15.聚苯乙烯，聚丙烯-来源：紫外线照射塑料管

16.胆酸盐-来源：粪便

17.胶原质-来源：组织

18.靛青染料-来源：粗斜纹棉布，牛仔裤

19.蛋白酶-来源：牛奶

20.钙离子-来源：牛奶，骨头

21.铁离子-来源：血液

22.二甲苯胺

23.溴酚蓝

24.胆红素

其他抑制剂

 

三、PCR抑制物作用机制

PCR抑制物中大部分的作用机制尚不完全清楚，但基本可以归为三类：

1.干扰核酸提取过程中的细胞裂解；

2.降解或包裹核酸；

3.热稳定DNA聚合酶失活；腐殖化合物是环境样本中最常见的抑制物，其可能是通过对Mg2+的螯合作用而抑制聚合酶活性。

DNA可因为一些物理、化学或酶等因素作用而出现降解，如贮存的扩增产物在扩增后电泳时，有时出现的条带模糊，就是因为DNA的降解所致。

DNA一级结构不稳定，会因为水解、非酶甲基化、氧化损伤和酶降解等出现降解。

细胞中存在核酸酶，如果核酸酶处理不干净，残留在核酸样本中，也会降解核酸。

微生物如细菌产生的限制性内切酶也是一个降解DNA的因素。

有些细菌的DNA酶属于热稳定的核酸酶，在扩增中期可水解基因组和引物DNA。

核酸和引物也因为其不能与DNA聚合酶结合而出现不扩增。

如蛋白质、多糖、细胞碎片、脂类等对PCR的抑制作用，很可能就是通过对DNA的物理包裹作用而使其不能与聚合酶接触。

乳胶手套上滑石粉对PCR扩增影响可能会通过其对DNA的非特异结合作用进行的。

因为DNA可结合至玻璃、二氧化硅等上，这也是采用硅吸附方法提取核酸的基本原理。

 

四、解决方法

了解完核酸抑制物之后，我们要如何减少这些抑制物对结果的影响呢？

主要的技术就是核酸提取。核酸分为DNA和RNA，将其从样本中提取出来，是进行PCR的前提。

将复杂样本核酸提取纯化出来，其目的是：

1.去除PCR抑制物；

2.增加靶核酸浓度，使其能达到特定PCR的测定范围；

3.增加样本的均一性，以保证测定的精密度和重复性。

 

除上述外，还可以使用PCR增强剂，比如甜菜碱、二甲基亚砜、甲酰胺、甘油、PEG、亚精胺和单链DNA结合蛋白等，但是在高浓度情况下，也会对PCR产生抑制，因此如何采用增强剂消除抑制剂的影响，采用多少的浓度对结果都存在很大的影响。