一、细菌生物膜培养与可视化
1.菌液制备
将铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa DSM 50071T）接种至LB培养基中，30°C、160 rpm振荡培养过夜。
按1:100比例稀释至含1:1000光示踪剂（EbbaBiolight 680）的TSB培养基中。
2.接种与培养
在µ-Slide I Luer 0.8通道载玻片（ibidi, 80196）中加入200 µL稀释菌液，密封后室温避光静置2小时，促进细胞沉降贴壁。
向两侧储液池各加入60 µL含光示踪剂的TSB培养基，30°C避光静态培养1-2天。
每36小时更换培养基（吸出100 µL旧液，加入100 µL新鲜含光示踪剂的TSB），持续培养3天，去除游离细胞并促进生物膜形成。
3.CLSM成像验证
DAPI染色：用1×PBS梯度置换培养基，加入DAPI染液（1 µg/mL），室温避光孵育10分钟，去离子水冲洗后1×PBS终洗。
成像参数：63×物镜，DAPI（蓝色，405 nm激发）与EbbaBiolight 680（红色，680 nm激发）双通道采集，观察单层/双层细菌结构及致密生物膜区域。
二、SEM样品制备
1.化学固定
用2.5%戊二醛（1×PBS配制）固定贴壁细胞，室温孵育3-4小时（或4°C过夜）。
用1×PBS冲洗5次，彻底去除戊二醛。
2.梯度脱水
依次用30%、50%、70%、90%乙醇孵育15分钟/次，使生物膜脱水。
用100%乙醇处理两次，每次20分钟，确保完全脱水。
3.干燥处理
临界点干燥：将载玻片置于55°C烘箱中干燥2小时，或使用CO₂临界点干燥仪，避免样品收缩变形。
切割模具分离：用3D打印模具精准分离盖玻片，保留生物膜区域，避免空间结构破坏。
4.导电镀膜
使用金镀膜机（如JEOL JFC-1200）对样品喷金，层厚约10 nm，增强导电性并减少电荷积累。
镀膜需均匀，避免掩盖样品表面特征。
三、SEM成像与观察
1.样品放置
将镀金后的样品观察面向上粘贴在扫描电镜铝板上，使用导电胶布固定，确保接触良好。
放入干燥器内备用，避免污染。
2.成像参数
加速电压：20 keV
放大倍率：2000×至15000×
观察生物膜表面形貌及三维结构，结合CLSM结果进行对比分析。
关键注意事项
1.无菌操作：所有步骤需在无菌条件下进行，避免污染。
2.避免干燥损伤：在CLSM染色及SEM脱水过程中，需梯度置换溶液，避免一次性移除全部液体导致细胞干燥。
3.固定与清洗：戊二醛固定后需彻底清洗，防止残留影响后续脱水及镀膜效果。
4.镀膜均匀性：喷金时间需适中（一般样品60 s，微生物样品延长10-20 s），避免金膜过厚掩盖微观细节。
5.切割模具使用：沿载玻片底部与储液池外边缘切割，确保生物膜区域完整保留。
