WB（Western Blot，蛋白质免疫印迹）实验中，总蛋白抽提是关键步骤，其质量直接影响后续电泳、转膜及抗体杂交的效果。

以下是总蛋白抽提的详细流程、注意事项及常见问题解决方案：

一、总蛋白抽提流程

1. 样本准备

细胞样本：

贴壁细胞：用PBS清洗2-3次，吸尽残留液体，加入适量裂解液（如RIPA裂解液），用细胞刮刀刮下细胞，转移至离心管。

悬浮细胞：直接离心收集细胞，PBS清洗后加入裂解液，涡旋振荡或超声破碎。

组织样本：

新鲜组织：剪取适量组织（如50-100 mg），用PBS清洗去除血液，剪碎后加入裂解液，用匀浆器或超声破碎仪裂解。

冷冻组织：从-80℃取出后迅速称重，按比例加入裂解液，冰上匀浆。

2. 裂解液选择

RIPA裂解液（常用）：

成分：含NP-40、脱氧胆酸钠、SDS等，可裂解细胞膜、核膜及细胞器膜，释放总蛋白。

补充：需加入蛋白酶抑制剂（如PMSF、Cocktail）和磷酸酶抑制剂（如NaF、β-甘油磷酸钠），防止蛋白降解。

其他裂解液：

NP-40裂解液：温和裂解，适用于膜蛋白提取。

Urea裂解液：含8 M尿素，用于难溶蛋白提取。

SDS裂解液：强变性条件，适用于膜蛋白或高疏水性蛋白。

3. 裂解条件

冰上操作：全程保持低温（4℃），防止蛋白降解。

裂解时间：

细胞：裂解液加入后冰上放置10-30分钟，期间每隔5分钟涡旋振荡或超声破碎（功率20-30%，每次3-5秒，间隔10秒）。

组织：匀浆后冰上放置30-60分钟，每隔10分钟涡旋振荡。

超声破碎：适用于高黏度样本（如组织匀浆液），可进一步破碎细胞核和细胞器，释放更多蛋白。

4. 离心去杂质

条件：12,000-14,000 ×g，4℃，离心10-15分钟。

目的：去除细胞碎片、核酸及未裂解细胞，收集上清（含总蛋白）。

注意事项：

避免吸到沉淀（可能含基因组DNA或细胞碎片）。

若上清黏稠，可延长离心时间或增加裂解液体积。

5. 蛋白定量

方法：BCA法或Bradford法。

BCA法：灵敏度高，受去垢剂（如SDS）影响小，适用于RIPA裂解液提取的蛋白。

Bradford法：快速，但受去垢剂干扰较大，需根据裂解液成分选择。

标准曲线：使用BSA作为标准品，绘制浓度-吸光度曲线，计算样本蛋白浓度。

稀释：根据定量结果，用裂解液或PBS将样本稀释至统一浓度（如2-5 μg/μL）。

6. 蛋白保存

短期：4℃保存（1-2天）。

长期：-80℃分装保存（避免反复冻融，每次使用前分装所需体积）。

变性处理：若需立即使用，可加入5×SDS-PAGE上样缓冲液，95-100℃加热5-10分钟使蛋白变性。

 

二、注意事项

1.防止蛋白降解：

裂解液中必须加入蛋白酶抑制剂（如PMSF需现用现加，终浓度1 mM）。

操作全程在冰上进行，减少蛋白酶活性。

2.避免交叉污染：

使用无RNase/DNase的枪头和离心管。

不同样本间更换枪头，避免交叉污染。

3.裂解液体积：

细胞：按每10⁶细胞加入100-200 μL裂解液。

组织：按每50 mg组织加入500-1000 μL裂解液。

4.超声破碎参数：

功率过高或时间过长可能导致蛋白断裂，需优化条件（如20%功率，3秒×3次）。

5.内参选择：

抽提总蛋白时需保留部分样本用于内参检测（如β-actin、GAPDH），确保上样量一致。

 

三、常见问题及解决方案

1.蛋白浓度低：

原因：裂解不充分、离心时吸到沉淀、样本量过少。

解决：增加裂解时间或超声破碎次数，重新离心并避免吸到沉淀。

2.蛋白降解：

原因：裂解液中未加抑制剂、操作温度过高、样本保存不当。

解决：补充蛋白酶抑制剂，全程冰上操作，-80℃分装保存。

3.样本黏稠：

原因：基因组DNA释放或裂解液中SDS含量过高。

解决：增加裂解液体积，或加入DNase I（10 U/mL）消化DNA，37℃孵育10分钟后终止反应。

4.蛋白聚集：

原因：反复冻融或加热变性时温度过高。

解决：避免反复冻融，加热时控制温度（95℃而非沸水浴）。

 

四、优化建议

1.预实验：首次抽提时，可设置不同裂解时间、超声条件或裂解液体积，通过WB检测目标蛋白表达量优化条件。

2.内参验证：抽提后立即取部分样本进行内参（如β-actin）检测，确保蛋白完整性。

3.裂解液配方调整：根据目标蛋白特性调整裂解液成分（如增加SDS浓度提取膜蛋白）。

 

通过规范操作和细节控制，可获得高质量的总蛋白样本，为后续WB实验提供可靠基础。