细胞免疫荧光实验主要用于定位和定性细胞内的抗原，以下是详细的实验步骤：

 

一、细胞准备

 

细胞培养

首先，根据实验需求选择合适的细胞系，如 HeLa 细胞（常用于研究细胞生理过程等）、RAW264.7 细胞（在免疫相关研究中应用较多）等。将细胞接种在盖玻片（用于后续观察）或细胞培养板（如 6 孔板、12 孔板等）中。

接种密度要合适，一般以细胞在培养 24 - 48 小时后能达到 70 - 80% 汇合度为宜。例如，对于 HeLa 细胞，在 6 孔板中每孔接种约 1 - 2×10^5 个细胞。

用含有适当比例血清（如 10% 胎牛血清）和抗生素（如 100 U/mL 青霉素和 100μg/mL 链霉素）的完全培养基，在合适的培养条件下（通常是 37°C、5% CO₂）培养细胞。

细胞固定

当细胞达到合适的生长状态后，弃去培养基，用预冷的磷酸盐缓冲液（PBS）轻轻洗涤细胞 2 - 3 次，每次洗涤时间约 3 - 5 分钟，以去除培养基中的血清等成分，防止其对后续固定过程产生干扰。

加入固定液，常用的固定液是 4% 多聚甲醛（PFA）。固定液的量要能完全覆盖细胞，一般在室温下固定 10 - 15 分钟。对于某些对固定条件敏感的抗原，也可以在 4°C 下固定，以减少抗原的破坏。

固定完成后，用 PBS 再次洗涤细胞 3 次，每次 5 分钟，以彻底去除固定液。

 

二、细胞通透

 

选择通透剂

如果检测的抗原是位于细胞内，需要使用通透剂使抗体能够进入细胞内部。常用的通透剂是 0.1% - 0.3% Triton X - 100。

进行通透处理

在细胞表面覆盖适量的通透剂溶液，一般在室温下处理 10 - 15 分钟。通透时间不宜过长，否则可能会破坏细胞结构和抗原。

通透结束后，用 PBS 洗涤细胞 3 次，每次 5 分钟，以去除通透剂。

 

三、封闭

 

准备封闭液

常用的封闭液是含有 1% - 5% 牛血清白蛋白（BSA）或 10% 正常山羊血清的 PBS 溶液。这些成分可以封闭细胞表面的非特异性结合位点，减少背景染色。

封闭操作

将封闭液加入细胞培养孔或覆盖在盖玻片上的细胞上，在室温下孵育 30 - 60 分钟。

 

四、一抗孵育

 

一抗稀释

根据一抗的说明书，用封闭液将一抗稀释到合适的浓度。不同的一抗稀释倍数可能不同，一般在 1:100 - 1:1000 之间。例如，某种抗细胞内蛋白的一抗可能需要稀释 1:500。

孵育过程

弃去封闭液，加入稀释好的一抗，一抗的量要能完全覆盖细胞。在 4°C 下孵育过夜或在 37°C 下孵育 1 - 2 小时。孵育过程中要注意保持细胞处于适当的湿度环境，可以将细胞培养板或盖玻片放在湿盒中。

 

五、洗涤

 

洗涤步骤

一抗孵育结束后，用 PBS 洗涤细胞 3 - 5 次，每次 5 - 10 分钟，以彻底去除未结合的一抗。洗涤过程中动作要轻柔，避免细胞脱落。

 

六、二抗孵育

 

二抗选择与稀释

选择与一抗来源物种相匹配的荧光标记二抗。例如，如果一抗是小鼠来源的，就要选择抗小鼠的荧光标记二抗。二抗也要用封闭液稀释，稀释倍数一般在 1:200 - 1:1000 之间。

孵育过程

弃去洗涤后的 PBS，加入稀释好的二抗，在 37°C 下避光孵育 30 - 60 分钟。因为荧光基团容易被光漂白，所以整个二抗孵育过程要严格避光。可以用锡箔纸等材料包裹细胞培养板或盖玻片。

 

七、再次洗涤

 

洗涤操作

二抗孵育结束后，用 PBS 洗涤细胞 3 - 5 次，每次 5 - 10 分钟，以去除未结合的二抗。

 

八、细胞核染色（可选）

 

染色试剂选择与操作

如果需要观察细胞核，可以使用细胞核染色试剂，如 DAPI（4',6 - 二脒基 - 2 - 苯基吲哚）。用 PBS 将 DAPI 稀释到合适浓度（一般为 1 - 5μg/mL）。

将稀释好的 DAPI 溶液加入细胞中，在室温下避光孵育 5 - 10 分钟。

孵育结束后，用 PBS 洗涤细胞 3 次，每次 5 分钟，以去除多余的 DAPI。

 

九、封片与观察

 

封片

用镊子小心地取出盖玻片（如果细胞是培养在盖玻片上），将其细胞面朝下放在载玻片上，在盖玻片周围滴加适量的封片剂（如抗荧光淬灭封片剂），以防止荧光淬灭并固定盖玻片。

观察

将封好片的载玻片放在荧光显微镜下观察。根据一抗和二抗所标记的荧光基团，选择合适的激发光波长进行观察。例如，若二抗标记的是 FITC（异硫氰酸荧光素），则可以用 488nm 的激发光进行观察。记录细胞内抗原的荧光信号分布情况，同时可以通过软件对荧光强度等参数进行分析。