一、检测原理
基于RPA结合CRISPR-Cas12a的等温扩增技术，可准确鉴定临床分离株中的分枝杆菌菌株。其工作示意图包括以下步骤：
使用RPA反应扩增部分rpoB基因：rpoB基因是分枝杆菌的一个保守基因，通过扩增该基因，可以为后续的CRISPR-Cas12a检测提供靶标。
用Cas12a切割靶DNA，然后反式切割荧光团-淬灭剂ssDNA-报告基因：当Cas12a与靶向rpoB基因的gRNA结合并识别靶DNA时，它会切割靶DNA，并激活其反式切割活性，切割周围的荧光团-淬灭剂ssDNA-报告基因，释放荧光信号。
通过蓝/白光透射仪观察释放的荧光信号，肉眼可见：荧光信号的释放表明存在目标分枝杆菌菌株。
二、检测优势
1.高特异性和灵敏度：对各种靶向分枝杆菌的检测限为1~100拷贝/反应，能够准确区分不同的分枝杆菌菌株。
2.反应速度快：一个小时内可以获得结果，大大缩短了检测时间。
.3快速、便携且用户友好：该检测方法不需要复杂的仪器设备，适合在资源匮乏的临床环境中使用。
三、检测流程
1.细菌菌株和临床样品的制备：提取参考菌株DNA和热灭活分枝杆菌，包括多种分枝杆菌菌株和临床分离株。使用小量制备试剂盒提取和纯化DNA。
2.靶向基因引物和gRNA设计：从ATCC和NCBI获得来自每个分枝杆菌物种的rpoB基因核苷酸序列，设计靶向rpoB基因的RPA引物并进行比对，同时制备gRNA。
3.重组酶聚合酶扩增（RPA）：使用TwistAmp Basic试剂盒进行RPA反应，总体积为10μL，含有冻干反应的再水化缓冲液、正向和反向引物、蒸馏水、基因组DNA模板和MgOAC。在39°C下孵育30分钟，然后在75°C下热灭活5分钟。
4.CRISPR-Cas12a检测方法：将含有gRNA、SrCas12a、荧光团淬灭基团报告基因、反应缓冲液和RPA产物的反应体系在39°C下孵育15分钟，然后使用蓝/白光透射仪观察荧光信号。
5.评估特异性并确定参考菌株的检测限：通过对多种分枝杆菌属的交叉反应性测试来评估gRNA的特异性，并通过连续稀释标准DNA靶标来确定检测限。
