一、样品制备
1.细胞/组织处理
快速操作：磷酸化修饰不稳定，需在冰上操作，缩短样品处理时间。
刺激条件优化：通过预实验确定最佳刺激时间（如EGF刺激5分钟）和浓度，避免过度刺激导致磷酸化信号下降。
裂解液选择：使用含磷酸酶抑制剂（如NaF、Na₃VO₄）和蛋白酶抑制剂的裂解液（如RIPA），现配现用以保持活性。
2.蛋白提取
低温裂解：4°C裂解细胞或组织，离心取上清，避免反复冻融。
定量与分装：用BCA法测定蛋白浓度，分装后-80°C保存，减少磷酸化修饰的降解。
二、电泳与转膜
1.电泳
凝胶配制：根据蛋白分子量选择合适浓度的SDS-PAGE胶（如8%-12%）。
上样量：磷酸化蛋白丰度低，可适当增加上样量（如30-50μg），但需避免过载导致条带变形。
2.转膜
湿转法：使用PVDF膜，转膜缓冲液中加入甲醇（20%）和SDS（0.0375%），低电压（100V）转膜1-2小时，确保小分子量蛋白充分转移。
转膜验证：丽春红染色或考马斯亮蓝染色确认转膜效率。
三、封闭与抗体孵育
1.封闭
封闭液选择：用5% BSA（TBST配制）封闭1小时，避免使用脱脂奶粉（含磷酸化酪蛋白，可能产生高背景）。
2.一抗孵育
抗体稀释：按说明书稀释磷酸化特异性抗体，推荐4°C过夜孵育，增强特异性结合。
对照设置：设置阳性对照（已知磷酸化样品）和阴性对照（未刺激样品），验证抗体特异性。
3.二抗孵育
二抗选择：使用HRP标记的二抗，室温孵育1小时，避免高背景。
洗膜：TBST洗膜3次，每次10分钟，摇床转速适中，避免过度洗涤导致信号丢失。
四、显影与数据分析
1.化学发光
底物选择：使用高灵敏度ECL底物，根据信号强度调整曝光时间（如10秒至5分钟）。
多通道成像：若需同时检测磷酸化和总蛋白，可用荧光二抗进行双色检测，减少条带剥离的误差。
2.数据分析
定量分析：用ImageJ软件测定条带灰度值，计算磷酸化蛋白与总蛋白的比值，排除上样量差异的影响。
重复实验：至少进行3次独立实验，确保结果可靠性。
五、常见问题与解决方案
1.高背景
原因：封闭不充分、抗体浓度过高、洗膜不彻底。
解决：优化封闭条件、降低抗体浓度、延长洗膜时间。
2.无信号或弱信号
原因：样品降解、抗体特异性差、上样量不足。
解决：检查样品保存条件、更换抗体、增加上样量。
3.非特异性条带
原因：抗体交叉反应、封闭液选择不当。
解决：优化抗体稀释比例、改用BSA封闭。
