一、ELISA检测技术原理

ELISA（酶联免疫吸附测定）是一种基于抗原-抗体特异性结合的免疫检测技术，通过酶催化底物显色实现定量或定性分析。其核心原理包括：

1.抗原-抗体特异性结合：将已知抗体或抗原固定在固相载体（如微孔板）上，与待测样本中的目标分子结合，形成抗原-抗体复合物。

2.酶催化显色反应：加入酶标记的抗体（或抗原），与复合物结合后，通过酶催化底物（如TMB）产生颜色变化，颜色深浅与目标分子浓度成正比。

3.信号放大与定量分析：酶的催化作用放大了免疫反应信号，可通过酶标仪测定吸光度值，结合标准曲线计算目标分子浓度。

 

二、ELISA操作流程

ELISA的操作流程通常包括以下步骤：

1.包被：

将特异性抗体或抗原用包被缓冲液稀释后，加入微孔板中，密封后4℃过夜或37℃温育2-3小时，使其充分吸附在孔壁上。

2.洗涤与封闭：

倒掉包被液，加入洗涤缓冲液洗涤3-5次，去除未结合物质。

加入封闭液（如牛血清白蛋白或脱脂奶粉溶液），37℃温育1-2小时，封闭未结合位点，减少非特异性吸附。

3.加样与孵育：

将待测样本用样本稀释液适当稀释后，加入微孔板中，同时设置阳性对照、阴性对照和空白对照，37℃温育1-2小时。

孵育结束后进行洗涤，去除未结合物质。

4.加酶标抗体与孵育：

用酶标二抗稀释液稀释酶标抗体后，加入微孔板中，37℃温育1-2小时。

孵育结束后进行洗涤，去除未结合的酶标抗体。

5.显色与终止反应：

加入底物溶液（如TMB），37℃避光显色10-30分钟。

当阳性对照出现明显颜色变化，阴性对照无明显变化时，加入终止液终止反应。

6.测定与数据分析：

用酶标仪在450nm或490nm波长下读取各孔的吸光度值（OD值）。

根据标准曲线计算样本中待测物质的浓度。

 

三、ELISA操作要点

1.试剂与仪器准备：

确保试剂盒内的试剂齐全且在有效期内，检查包被抗体、酶标抗体、底物等是否完好。

准备好酶标仪、移液器、恒温箱等实验仪器，并确保其正常工作。

2.样本处理：

根据实验样本类型（如血清、血浆、细胞培养上清等）收集样本，避免杂质干扰。

血清标本应避免溶血和细菌污染，可短时间4℃保存或低温冰存。

3.操作规范：

加样：避免气泡和交叉污染，确保加样准确。每次加样应更换吸嘴，或使用一次性定量塑料管。

温育：37℃温育1-2小时，确保抗原抗体充分反应。温育方式可采用水浴或湿盒，避免蒸发和叠放。

洗涤：彻底洗涤是关键，可采用浸泡式或流水冲洗式，确保去除未结合物质。

4.显色与比色：

显色时间需严格控制，比色时需校准仪器，选择合适波长。

5.结果分析：

定性检测可通过目视或比色法判断阳性或阴性。

定量检测通过标准曲线法，根据吸光值确定标本中待测物质的浓度。

 

四、ELISA技术类型与应用

1.直接ELISA：

将酶标记的抗体直接与包被在固相载体上的抗原结合，适用于检测大分子抗原。

2.间接ELISA：

通过两步反应进行检测，先加入特异性检测抗体与抗原结合，再加入酶标记的二抗与检测抗体结合，适用于检测抗体。

3.夹心ELISA：

包括双抗体夹心法和双抗原夹心法，通过特异性抗体与抗原的双重结合实现高灵敏度检测，适用于检测血液中的蛋白质、病毒抗原等。

4.竞争ELISA：

基于抗原与抗体竞争性结合的原理，适用于小分子抗原或半抗原的检测，如激素、药物等。

 

五、ELISA技术优势

1.高灵敏度与特异性：

酶的催化作用放大了免疫反应信号，可实现微量物质的检测。

基于抗原抗体的高度特异性结合，确保检测的准确性。

2.操作简便与经济高效：

操作步骤相对简单，适合大规模筛查和高频率监测场合。

试剂盒成本相对较低，且可重复使用，降低了实验成本。

3.结果稳定可靠：

只要遵循正确的储存和操作指导，ELISA试剂盒能够保证检测结果的稳定性和一致性。