一、Transwell 实验原理

Transwell 孔板具有独特的上下两室设计，中间隔以选择性通透膜。上室通常用于接种细胞，下室则放置含有各种诱导因子（如趋化因子、生长因子等）的培养基。

在适宜的培养条件下，上室中的细胞受到下室诱导因子的吸引或在自身内在机制的驱动下，尝试穿过通透膜向下方迁移。

通过对迁移细胞的数量、形态以及迁移距离等指标的观察和分析，可以定量或定性地评估细胞在不同条件下的迁移能力，进而揭示细胞迁移相关的生物学机制，如疾病转移过程中肿瘤细胞的侵袭行为、炎症反应中免疫细胞的定向移动以及细胞信号转导通路对迁移的调控等。

 

二、实验准备工作

（一）试剂与材料准备

1.Transwell 孔板：选择合适规格和材质的 Transwell 孔板，确保通透膜的质量和性能符合实验要求。常见的膜材质有聚碳酸酯（PC）和聚酯（PET）等，其孔径大小可根据研究的细胞类型和实验目的进行选择，如 8μm 孔径常用于肿瘤细胞迁移研究，3μm 孔径适用于淋巴细胞等较小细胞的迁移实验。

2.细胞培养基：根据所培养细胞的种类和特性，准备相应的完全培养基，以维持细胞的正常生长和生理状态。同时，还需要准备无血清培养基用于下室，以避免血清中的成分对细胞迁移实验的干扰。

3.细胞培养物：培养和处理待进行迁移实验的细胞，确保细胞处于对数生长期，状态良好且数量足够。在接种前，需对细胞进行计数和活力检测，以保证实验的准确性和可重复性。

4.其他用品：准备好移液器（不同量程，用于精确移取细胞悬液、培养基等）、显微镜（用于观察细胞形态和迁移情况）、PBS（磷酸盐缓冲液，用于洗涤细胞和孔板）、甲醛或 Crystal Violet（用于细胞染色固定）等试剂和器材。

（二）细胞处理要点

1.培养条件优化：在细胞培养过程中，严格控制培养环境的温度（37°C）、湿度（通常 95% 左右）和 CO₂浓度（5%），确保细胞生长稳定。根据细胞类型和实验需求，选择合适的培养器皿和培养面积，定期更换培养基，以提供充足的营养物质并去除代谢废物。

2.细胞状态监测：通过显微镜定期观察细胞形态、生长状态和密度，避免细胞过度生长或受到污染。在进行 Transwell 实验前，对细胞进行充分的消化和吹散处理，确保细胞呈单细胞悬液状态，便于准确计数和均匀接种。

 

三、Transwell 实验详细步骤

（一）Transwell 孔板准备

取出 Transwell 孔板，使用 PBS 或培养基轻柔地预洗孔板，目的是去除可能残留在孔板中的保存液或杂质，防止其对后续实验产生影响。

预洗时要注意操作轻柔，避免损伤通透膜。

将适量的完全培养基添加至上室孔板中，使液面保持平整，一般上室培养基体积根据孔板规格而定（如 24 孔 Transwell 板，上室可加入 100 - 200μL 培养基）。

同时，在下室孔板中加入含有诱导因子的无血清培养基，下室培养基体积通常较上室多（如 600 - 800μL），以确保有足够的诱导因子浓度梯度形成，吸引细胞迁移。

（二）细胞接种

准确计数并调整细胞浓度后，取适量的细胞悬浮液缓慢加入上室孔板中。注意控制细胞数量和密度，细胞数量过多可能导致过度拥挤，影响迁移效果；数量过少则可能使迁移细胞难以观察和统计。

一般根据细胞类型和实验目的，通过预实验确定合适的接种细胞数（如每孔 5×10⁴ - 5×10⁵个细胞）。

将接种好细胞的上室孔板轻轻放入含有无血清培养基的培养皿中，确保孔板与培养基充分接触，避免产生气泡或倾斜，以保证细胞在稳定的环境中开始迁移实验。

（三）培养条件设置

将 Transwell 孔板平稳放置于 37°C 恒温培养箱中，保持培养箱内湿度在 95% 左右，CO₂浓度为 5%。这些稳定的培养条件对于维持细胞的正常生理功能和迁移活性至关重要。

培养时间根据细胞类型和实验设计而定，一般为 12 - 48 小时，期间尽量减少对培养箱的开关次数，避免温度、湿度和 CO₂浓度的波动对细胞迁移产生干扰。

（四）细胞观察与分析

在规定的培养时间结束后，小心取出 Transwell 孔板，用 PBS 缓慢且轻柔地洗涤上室，去除未迁移的细胞。洗涤过程要避免过度用力，防止已迁移细胞脱落。

 选择合适的染色方法对细胞进行固定和染色，常用的染色剂有甲醛（固定细胞形态）和 Crystal Violet（使细胞着色便于观察）。

染色后，用显微镜观察并记录细胞迁移情况。可以通过计数迁移到膜下方的细胞数量、测量迁移距离或拍摄细胞迁移图像进行定性和定量分析。例如，使用图像分析软件对迁移细胞进行计数和面积测量，以获取客观准确的数据。

 

四、实验注意事项与小技巧

（一）细胞数量控制

合理的细胞密度是获得可靠实验结果的关键因素之一。过高的细胞密度可能导致细胞间相互竞争营养物质和空间，影响细胞迁移能力的正常发挥；而过低的密度则可能使迁移细胞数量过少，难以准确统计和分析。

因此，建议在正式实验前进行前期优化实验，通过设置不同的细胞接种数量梯度，观察并确定最适合的细胞密度，以确保实验结果的准确性和可重复性。

（二）培养条件维护

稳定的培养条件对于细胞迁移实验至关重要。培养箱内的温湿度和 CO₂浓度应保持恒定，定期对培养箱进行校准和维护，确保其性能稳定。同时，在实验过程中应尽量避免频繁开关培养箱门，防止温度、湿度和 CO₂浓度的瞬间波动对细胞产生应激反应，影响迁移实验的正常进行。

（三）定期观察与记录

在实验过程中，定期（如每 4 - 6 小时）使用显微镜观察细胞迁移情况，及时记录细胞形态、迁移方向和迁移距离等信息。

这不仅有助于实时了解实验进展，还能及时发现可能出现的问题（如细胞污染、膜损伤等），以便采取相应的措施进行调整或补救。同时，详细记录观察结果和操作步骤，为后续的数据分析和实验重现提供重要依据。

（四）实验器材准备与消毒

每次使用前，确保 Transwell 孔板和其他实验器具（如移液器吸头、培养皿等）都经过严格的消毒和清洁处理。

可以采用高压灭菌、紫外线照射或化学消毒等方法，彻底清除可能残留的细菌、病毒或其他杂质，避免污染实验样本，影响实验结果。

 提前准备好所有所需的试剂和材料，并确保它们处于适当的储存条件下。

例如，细胞培养基应存放在 4°C 冰箱中，避免光照和反复冻融；PBS 应在室温下保存，使用前检查其 pH 值是否在正常范围；染色剂应按照说明书要求避光保存等。

（五）操作细节注意

 在孔板操作过程中，应将移液器笔尖或其他操作器具轻柔地放置在孔板表面，避免对孔板膜造成损伤。任何微小的膜损伤都可能导致实验结果的偏差，如细胞泄漏或异常迁移。

确保细胞接种均匀，可通过轻轻摇动孔板或使用轻柔吹气等方式使细胞悬液在孔内均匀分布。不均匀的接种可能导致局部细胞密度过高或过低，影响迁移结果的准确性。

在取出 Transwell 孔板进行观察前，先用 PBS 缓慢冲洗孔板，以去除表面的杂质和未贴壁细胞，但要避免过度干燥或损伤细胞。冲洗后，尽快进行染色和观察，防止细胞状态发生变化。