提高蛋白质提取浓度的策略
1.优化细胞裂解步骤
a. 选择合适的裂解液
裂解液的选择对蛋白提取的效率和质量有着至关重要的影响。RIPA裂解液是一种常用的强力裂解液，适合用于提取细胞和组织中的蛋白质。它的主要成分包括Tris缓冲液、NaCl、去污剂（如Triton X-100、sodium deoxycholate和SDS）、焦磷酸钠、β-甘油磷酸、EDTA、Na3VO4和peptide inhibitors等。这些成分可以有效地裂解细胞，并抑制蛋白质的降解。
如果目标是提取胞浆蛋白，可以选择相对较温和的裂解液；如果目标是膜蛋白，则需要较强的裂解液。有些研究表明，加入SDS后裂解能力会明显增强。
b. 规范裂解操作
①洗涤细胞 ：用预冷的PBS缓冲液洗涤细胞三次，以去除残留的培养基和其他杂质。这样可以减少裂解过程中不必要的污染。
②加入适量的裂解液 ：确保覆盖所有的细胞，并在冰上裂解15-30分钟。这一步可以通过使用细胞刮刀将细胞刮下，并转移到离心管中。
③离心收集 ：在4℃条件下，以12,000rpm离心15分钟，收集上清液即为总蛋白。上清液中的蛋白质浓度较高，沉淀中的大部分是细胞碎片和其他不溶性物质。
c. 调整裂解时间
裂解时间的长短会影响蛋白质的提取效率。适当的延长裂解时间（如30分钟以上）可以提高蛋白质的释放效率。如果发现裂解后仍有大量未裂解的细胞，可以通过超声破碎仪进一步处理。
2.增加细胞数量
提高初始细胞的数量可以显著增加蛋白质的提取总量。例如，可以将细胞数量增加到1.5×10^7个或更多，同时适当增加裂解液体积，以确保充分裂解。
3.使用蛋白酶和磷酸酶抑制剂
在裂解液中添加蛋白酶和磷酸酶抑制剂可以有效防止蛋白质被降解。常用的抑制剂包括PMSF、leupeptin、pestatin A等。这些抑制剂可以单独或组合使用，以最大限度地减少蛋白质的降解。
4. 优化裂解液配方
根据目标蛋白质的性质，调整裂解液的成分和pH值。例如，如果目标蛋白质富含膜蛋白，可以选择含有较高浓度去污剂的裂解液。如果目标蛋白质对pH敏感，可以适当调整pH值以保持其稳定。
5.使用商业化试剂盒
市面上有许多商业化试剂盒（如凯基、碧云天等厂家的全蛋白提取试剂盒）设计用于快速高效地提取蛋白质。这些试剂盒通常包含优化的裂解液和抑制剂，能够在短时间内高效提取蛋白质，并保持其天然活性。
6.优化储存和处理条件
a. 低温操作
在整个蛋白提取过程中，保持低温操作是至关重要的。所有操作尽可能在冰上或4℃条件下进行，以减缓蛋白质的降解和变性。
b. 避免反复冻融
反复冻融会导致蛋白质变性和降解。因此，提取的蛋白质样品应当分装后储存于-80℃，以减少反复冻融次数。
c. 加入稳定剂
为了防止蛋白质在储存过程中的降解和变性，可以在裂解液中加入适量的稳定剂，如DTT（二硫苏糖醇）或β-巯基乙醇，这些还原剂能够防止蛋白质的二硫键形成，保持蛋白质的稳定。
