在 Western Blot（WB）实验中，凝胶的制备是至关重要的基础环节，其质量直接影响后续实验结果的准确性与可靠性。本文将深入探讨配胶过程中常见的问题，剖析其可能原因，并提供切实可行的解决方法，助力科研人员优化实验流程，提升实验成功率。

一、凝胶凝结问题

1.凝结不良（有花纹、不均匀）

现象描述：在冬季低温环境下，高浓度胶的分离胶下部易出现波浪样花纹，凝胶不均匀。

原因分析：低温会减缓凝胶聚合反应速率，导致凝胶形成过程中结构不均匀。

解决措施：适当增加促凝剂（TEMED 和过硫酸铵）的用量，加速凝结过程。同时，确保玻璃板清洁，避免残留胶干扰凝胶形成。例如，在使用前用去离子水彻底清洗玻璃板，并擦干。

2.胶易碎（操作中破裂）

现象描述：低浓度胶（用于跑大分子蛋白）在操作过程中易破裂。

原因分析：低浓度胶本身结构相对脆弱，在室温较低时，凝胶聚合不完全，使其更易受损。

解决措施：操作时动作务必轻缓，避免过度晃动或挤压凝胶。室温较低时，可适量增加促凝剂用量，促进凝胶充分聚合。比如，可将促凝剂用量提高 10% - 20%，但需注意避免过量导致凝胶过硬。

3.胶不凝

现象描述：凝胶无法正常凝固。

原因分析：温度过低会显著影响凝胶聚合反应，过硫酸铵若不新鲜，其产生游离基的能力下降，无法有效引发聚合反应。缓冲溶液的配制问题也可能导致凝胶不凝。

解决措施：温度低时加大促凝剂用量，且过硫酸铵必须现配现用。若问题仍未解决，需重新配制缓冲溶液，确保缓冲体系的稳定性和有效性。

二、电泳后杂带问题

上有长条纹杂带

现象描述：电泳完成后，胶上出现许多长条纹杂带。

原因分析：配胶溶液不纯或未充分混匀，会使凝胶内部成分不均匀，影响蛋白质电泳迁移；电泳缓冲液回收使用次数过多，杂质积累，也会干扰蛋白质的正常电泳。

解决措施：保证配胶溶液的纯度，使用前充分混匀，可采用搅拌和超声等方法确保溶液均匀性。严格控制电泳缓冲液的回收使用次数，建议尽量不回收。若考虑成本想节约电泳液，可在内槽加入新配制的缓冲液，外槽使用回收的缓冲液。

三、凝胶时间问题

凝胶时间异常（过慢或过快）

现象描述：自配胶正常凝结时间在 30 分钟到 1 小时内，商品化试剂盒在 10 - 20 分钟内。若凝得太慢，可能影响实验进度；凝得太快，胶太硬易裂且电泳时易烧胶。

原因分析：凝胶时间主要受促凝剂用量和环境温度影响。促凝剂剂量不足会导致凝胶聚合缓慢；而用量过多则使聚合反应过快，导致凝胶结构不理想。

解决措施：根据实际情况精准调整促凝剂加入量。同时，注意实验环境温度，可在适宜温度范围内（如 15 - 25°C）进行凝胶制备，以保证凝胶时间的稳定性。

四、凝胶物理形态问题

1.浓缩胶与分离胶断裂或梳孔间浓缩胶倾斜

现象描述：浓缩胶与分离胶之间出现断裂，或梳孔间的浓缩胶倾斜。

原因分析：拔梳子时用力不均匀或过猛，会破坏凝胶的完整性，导致其结构受损。

解决措施：拔梳子时应均匀用力，垂直向上缓慢拔出。若出现拔歪情况，可用注射器针头小心矫正后再进行上样操作，确保上样的准确性和凝胶结构的完整性。

2.板间有气泡

现象描述：制胶夹子解除后，板间出现气泡。

原因分析：板未压紧，空气进入板间形成气泡。

解决措施：确保在制胶过程中板间紧密贴合，如使用夹子夹紧玻璃板时要保证压力均匀。若气泡不在上样孔对应位置，一般对电泳影响较小，但为保证实验严谨性，尽量避免气泡产生。

五、相关试剂作用原理（知识拓展）

1.TEMED（N,N,N',N' - 四甲基二乙胺）

TEMED 作为聚合加速剂，其游离碱基能促进过硫酸铵（AP）形成 SO42 - ，从而使丙烯酰胺单体的双键打开，活化形成自由基丙烯酰胺。这些自由基丙烯酰胺相互作用，进而聚合形成凝胶的三维网状结构。

2.过硫酸铵（AP）

AP 在水溶液中分解产生游离基 SO42 - ，这是引发丙烯酰胺单体聚合的关键。它能打开丙烯酰胺单体的双键，使其活化形成自由基丙烯酰胺，随后与交联剂共同作用形成凝胶。

3.Bis - Acr（丙烯酰胺）

丙烯酰胺单体和交联剂 N,N′ - 亚甲基双丙烯酰胺在催化剂作用下聚合成含有酰胺基侧链的脂肪族长链，相邻链通过亚甲基桥交联，构建起三维网状结构的聚丙烯酰胺凝胶，为蛋白质电泳提供了稳定的载体。

4.十二烷基硫酸钠（SDS）

SDS 是一种阴离子去垢剂，在 WB 实验中具有重要作用。它能去除蛋白质的电荷，解离蛋白质之间的氢键，消除蛋白分子内的疏水作用，并去除多肽折叠。当蛋白质与含有强还原剂的 SDS 溶液结合时，会形成 SDS - 蛋白质复合物。该复合物因结合大量带负电荷的 SDS，掩盖了蛋白质本身的电荷差异，使不同蛋白质在电泳过程中仅根据分子量大小进行分离，提高了电泳分辨率。