一、磷酸化蛋白的样品准备
样品选择与预处理：确保磷酸化蛋白的可检测性
选择合适的样品是实验成功的关键。磷酸化蛋白通常含量较低，因此需要精心选择样品并进行适当处理。
操作步骤：
1.样品来源：选择表达目的蛋白的细胞或组织作为样品来源。可以通过文献调研或预实验来确定哪些样品中目的蛋白的表达量较高。
2.样品处理：如果需要，对细胞进行物理（如热激、机械刺激）或化学（如生长因子、细胞因子或药物）刺激，以诱导特定信号通路的激活和磷酸化蛋白的表达。
3.刺激条件确定：根据文献报道和预实验结果，确定最佳的诱导条件（如刺激剂的浓度、处理时间等）。
4.磷酸化水平的初步评估：了解蛋白的磷酸化状态
在实验前，进行磷酸化水平的初步评估，有助于设计实验和选择抗体。
操作步骤：
1.数据库查询：使用PhosphoSitePlus数据库查询目的蛋白的已知磷酸化位点，了解其磷酸化状态和生物学功能。
2.抗体选择：根据数据库信息和文献报道，选择特异性识别磷酸化位点的抗体。
3.对照设置：
阳性对照：选择已知表达磷酸化蛋白的细胞或组织作为阳性对照，验证抗体的特异性。
阴性对照：设置未处理或处理条件不诱导磷酸化的样品作为阴性对照，以排除非特异性信号的干扰。
通过上述步骤，可以确保样品中磷酸化蛋白的可检测性，并为实验设计提供重要信息。这将有助于提高实验的成功率，并确保结果的可靠性。
二、磷酸化蛋白的提取技巧
在生物实验中，磷酸化蛋白的提取是一个要求极高的过程。磷酸化是一种动态且快速的反应，因此在提取过程中，保持低温是至关重要的。这可以最大限度地减少磷酸化蛋白的降解，保证样品的新鲜度和实验结果的准确性。
操作步骤：
1.使用预冷的PBS（磷酸盐缓冲液）洗涤细胞，确保在冰上进行所有操作，包括细胞收集和裂解。
2.对于组织样本，使用液氮研磨的方法，并确保研磨器具预先冷却，以保持蛋白的活性和磷酸化状态。
3.快速将样品转移到冰上的离心管中，并在低温条件下进行裂解。
裂解液的配制：
裂解液的配制是提取磷酸化蛋白的另一个关键步骤。在组织或细胞裂解时，会释放出内源性蛋白磷酸酶，这些酶会催化磷酸化蛋白的去磷酸化，从而影响实验结果。
配制步骤：
1.准备含有蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂的裂解液。对于检测酪氨酸磷酸化的抗体，还需要添加原钒酸钠以抑制酪氨酸磷酸酶的活性。
2.避免裂解液的反复冻融，以保持其新鲜度和活性。可以使用市售的裂解液，如RIPA缓冲液，或者根据需要自行配制。
3.裂解液的具体配方可能包括：50 mM Tris-HCl pH 7.4、150 mM NaCl、1 mM EDTA、1% Triton X-100、1% Sodium deoxycholate、0.1% SDS、1 mM PMSF、1 mM Na3VO4等。
磷酸化蛋白提取的详细操作
细胞裂解：
1.收集胰蛋白酶消化的细胞并离心，用PBS清洗。
2.使用含有磷酸酶抑制剂的裂解缓冲液（如RIPA缓冲液）冰浴溶解沉淀10分钟。
3.高速离心，取上清转移至新管。
4.使用BCA法检测蛋白质浓度，调整蛋白浓度至5mg/ml，分装后储存于-80℃。
组织裂解：
1.切开组织，称取组织于PBS中清洗。
2.在RIPA缓冲液中剪碎组织后，转移到匀浆器中，加足量的RIPA缓冲液，研磨20分钟。
3.将研磨液转移到离心管中，高速离心，取上清液作为完整的组织裂解液。
4.测定蛋白质浓度，调整蛋白浓度，分装后储存于-80℃。
通过上述步骤，可以有效地提取磷酸化蛋白，为后续的实验分析打下坚实的基础。记住，始终保持低温操作，使用新鲜的裂解液，并在实验过程中加入足够的抑制剂，是成功提取磷酸化蛋白的关键。
三、内参的选择与应用
1.磷酸化蛋白与总蛋白的内参设置
在磷酸化蛋白的检测中，设置两个内参是至关重要的。首先，需要设置一个与磷酸化蛋白对应的总蛋白内参，这样可以通过比较磷酸化蛋白与总蛋白的比值变化来评估磷酸化水平的变化。其次，设置一个普通内参，如actin或GAPDH，可以作为体系的对照，确保上样量的一致性，从而排除体系本身的影响。
2.普通内参的作用
普通内参，如actin和GAPDH，是实验中不可或缺的组成部分。它们作为体系的对照，确保了不同样品之间的上样量一致性。这对于结果的准确分析至关重要，因为任何上样量的差异都可能导致结果的误读。因此，在实验中，选择一个稳定表达的内参，并通过定量分析来确保上样量的一致性，是获得可靠结果的关键。
四、Western Blot操作中的注意事项
样品量的确定：找到最佳上样量
磷酸化蛋白的丰度通常较低，因此需要通过预实验来评估样品中磷酸化蛋白的丰度，并据此调整上样量。通常，我们需要在凝胶上加载更多的样品来确保磷酸化蛋白的条带可以被检测到。然而，过多的样品量也可能导致条带过载，影响结果的解读。因此，找到合适的平衡点是关键。此外，考虑到不同样品间可能存在的变异，使用相同的样品处理和加载条件对于确保结果的可比性至关重要。
操作步骤：
1. 通过预实验，使用BCA蛋白浓度定量的方法确定样品中蛋白的浓度。
2. 根据蛋白的浓度和目标蛋白的丰度，确定上样量。通常，细胞裂解液或组织匀浆的总蛋白上样量为20-30 μg，纯化蛋白的上样量为10-100 ng。
3. 在凝胶上加载等量的蛋白和分子量标志物，选择合适的凝胶百分比进行电泳。
抗体的选择与孵育
高质量的抗体是Western blot实验成功的关键。选择抗体时，应优先考虑那些在文献中被广泛引用和验证的抗体。此外，抗体的特异性和亲和力也是重要的考量因素。在实验中，我们可以通过调整一抗的浓度和孵育时间来优化实验结果。
操作步骤：
1. 选择特异性高、亲和力强的抗体，最好选择在文献中被广泛引用和验证的抗体。
2. 将一抗用Western Antibody Dilution Buffer按照合适比例进行稀释，通常在4°C下过夜孵育，以确保抗体有充足的时间与抗原结合。
3. 一抗孵育结束后，用洗涤缓冲液冲洗膜两次，随后在摇床洗涤膜1次，时长15分钟，再洗涤膜3次，每次10分钟。
4. 二抗孵育前，先在封闭缓冲液中稀释二抗，通常在室温下孵育一小时，但抗体浓度和孵育时间需要优化。
Western Blot操作细节
Western Blot实验中的每一步都至关重要，从样品制备到封闭，再到抗体杂交，每个步骤都需要精心操作以确保实验的准确性。
操作步骤：
1. 在样品制备时，保持低温操作，避免反复冻融，以防止蛋白降解。
2. 凝胶配制时，控制聚合时间，分离胶聚合时间控制在10—20分钟，浓缩胶最佳聚合时间为8-10分钟。
3. 电泳时，确保凝胶充分凝固，两板玻璃之间排除所有气泡，加样前离心，选择适当的样本缓冲液。
4. 转膜时，注意缓冲液的pH值和甲醇的使用，确保蛋白质有效转移。
5. 封闭时，使用适当的封闭液，并注意封闭液的保存和使用。
6. 抗体杂交时，适当降低抗体浓度，增加洗膜次数，优化转移时间和电流，增加抗体的浓度，适当延长曝光时间。
五、抗体孵育与洗脱的策略
条带位置的一致性：
在Western blot实验中，磷酸化蛋白和其对应的总蛋白在凝胶上的迁移位置非常接近，这是因为磷酸化修饰通常不会显著改变蛋白的分子量。这种一致性允许我们在同一张膜上先后检测磷酸化蛋白和总蛋白，从而直接比较它们的表达水平。
操作步骤：
1.预实验评估：通过预实验评估样品中磷酸化蛋白的丰度，据此调整上样量，通常需要在凝胶上加载更多的样品。
2.平衡点的寻找：过多的样品量可能导致条带过载，影响结果的解读，因此找到合适的平衡点是关键。
3.样品处理的一致性：使用相同的样品处理和加载条件，以确保结果的可比性。
洗脱液的配制与使用：
抗体剥脱液的配制相对简单，通常包含Tris-base、SDS和β-巯基乙醇。这种溶液可以有效地去除已结合的抗体，但同时也可能影响蛋白的稳定性。因此，控制洗脱过程中的温度和时间至关重要。
操作步骤：
1.洗脱液配制：按照一定比例配制含有Tris-base、SDS和β-巯基乙醇的洗脱液。
2.温度控制：一般建议在50°C下进行30分钟的洗脱，以去除抗体的同时，最大程度地保护目的蛋白。
3.操作细节：确保膜完全浸泡在洗脱液中，并使用塑料膜封好，以保证受热均匀，避免在后续的总蛋白检测中出现不均匀的条带。
抗体洗脱液的使用：
在Western blot实验中，为了节省成本和提高效率，经常需要对已经孵育的抗体进行洗脱，以便在同一张膜上进行多次检测。
操作步骤：
1.洗脱液加热：将抗体洗脱液加热至60℃左右。
2.膜的放置与洗脱：将已经孵育的膜放入洗脱液中，轻轻摇动或震荡10-15分钟。
3.彻底清洗：取出膜，用PBS缓冲液洗涤3次，每次5分钟，以去除残留的抗体和保护膜的完整性。
4.预处理：用TBST缓冲液预处理膜，孵育10-15分钟，然后按照常规方法孵育使用。
通过上述步骤，可以有效地实现抗体的洗脱和膜的再生，为后续的总蛋白检测或其他检测提供可能。这种方法不仅提高了实验的效率，也节省了实验成本。
