RNA修饰点杂交是一种用于定量检测和分析RNA样本中化学修饰水平的实验技术。比如m6A 点杂交（m6A Dot Blot），可以评估RNA样品中m6A修饰的总体水平，而不是其在特定mRNA上的位置或频率。

这里以m6A修饰为例，其他修饰实验方法一样，抗体不同。

一、实验原理

m6A 点杂交实验的基本原理是将RNA样本点样到硝酸纤维素膜上，并使用特异性抗体检测m6A修饰。首先，RNA样本被均匀地点样到膜上并固定，然后使用针对m6A的特异性抗体进行孵育，通过与抗体结合的m6A的量来反映样本中m6A的水平。最后，通过适当的检测方法（如化学发光）来定量m6A的丰度。

二、实验意义

表观遗传学研究：通过m6A点杂交，可以测量不同条件下或不同生物样品中m6A的总水平，从而研究其在表观遗传调控中的作用。对于大规模样品的m6A水平快速筛选非常有效，可以用于初步评估和筛选，为进一步的深入研究提供依据。

三、实验缺点

1.信息有限：无法提供m6A修饰在特定RNA序列上的精确位置信息。    

2.敏感性和特异性问题：抗体的特异性和敏感性可能影响实验结果的准确性，抗体与m6A的结合强度和特异性是实验成功的关键。

3.定量问题：虽然可以进行定量分析，但结果的精确度受到实验操作和条件的影响较大，需要严格的标准化和控制。

m6A 点杂交是一个有力的工具，尤其是在需要处理大量样本时，但是为了获得更精确的m6A修饰信息，通常需要与其他技术（如m6A-seq）结合使用。

四、实验方法

1.用TRIZOL’提取RNA。用TRIZOL提取的RNA为总RNA，如果想要研究某种RNA上的特殊修饰，可以进一步纯化，比如mRNA纯化试剂盒。

2.对RNA进行定量，并尽量配成相同浓度，这里注意使用无酶水。#NanoDrop的定量不是特别准确，保证十位数字相同就可以。细胞密度保持一致，容易保持RNA浓度近似。

3.抽取需要的体积的样品，PCR 仪中 95 ℃ 反应 5 min，使核酸变性。迅速放回冰上。

4.在裁剪的合适大小的硝酸纤维膜上进行点样。#这里推荐进口的NC膜。在同一个点上可以重复上样，第一次点的微干后，再进行下一次点样，每次上样量不超过1uL。上样量一般在500-1000ng，这里可以进行摸索。

5.样品风干后，在 302 nm 紫外灯下照射交联 6 min。#没有可以调节紫外强度的仪器，可以尝试超净台的紫外。

6.交联后，用 PBST 缓冲液洗涤膜 5 min；然后用 5% 的脱脂奶粉+1%BSA室温封闭 2 h，用 m6A 抗体在 4 ℃ 下孵育过夜。    

7.第二天，在 PBST 缓冲液中洗涤 4 次，每次 5 min，用对应的二抗 IgG 在室温下孵育1 h，再用 PBST 缓冲液洗涤 4 次，每次 5 min。

8.利用 ECL 显色液进行 ECL 显影。#这里推荐超敏显影液。

9.亚甲基蓝定量核酸：将膜放置于亚甲基蓝染色溶液中染色 10 min，PBST 洗涤 10 min，期间更换多次 PBST 后，拍照。#这里推荐成品的亚甲蓝染液，亚甲蓝粉末真的不好配！

实验注意：这个过程中尽量使用无酶产品。