一、基于亲和力的靶点捕获技术

1.亲和层析（Affinity Chromatography）

原理：将活性分子固定在固相载体上，与细胞裂解液孵育后，通过洗脱和质谱分析捕获的蛋白，鉴定潜在靶点。

特点：直接、高效，但可能受非特异性结合干扰。

应用：适用于高亲和力活性分子的靶点筛选。

2.药物亲和反应靶点稳定性（DARTS）

原理：活性分子与靶蛋白结合后，可保护靶蛋白免受蛋白酶降解，通过质谱分析降解前后的蛋白差异，鉴定靶点。

特点：无需标记活性分子，操作简便，但可能存在假阳性。

应用：适用于小分子或天然产物的靶点发现。

3.细胞热位移分析（CETSA）

原理：活性分子与靶蛋白结合后，可稳定靶蛋白的热变性，通过检测不同温度下蛋白的溶解性变化，鉴定靶点。

特点：可区分直接和间接靶点，但需优化温度梯度。

应用：适用于热稳定性较好的蛋白靶点。

4.生物素标记-链霉亲和素沉淀（BioID/TurboID）

原理：通过基因工程将生物素连接酶（BirA或其突变体）与活性分子或其受体融合表达，在细胞内生物素化邻近蛋白，结合质谱分析鉴定靶点。

特点：可捕获弱相互作用或瞬时结合的蛋白，但需基因改造。

应用：适用于研究蛋白质相互作用网络。

 

二、基于遗传学的靶点发现方法

1.全基因组CRISPR筛选

原理：利用CRISPR-Cas9技术敲除细胞中的每个基因，观察活性分子处理后的细胞表型变化（如存活率、增殖能力），鉴定靶基因。

特点：高通量、无偏性，但需建立稳定的细胞模型。

应用：适用于癌症药物靶点发现和耐药机制研究。

2.RNA干扰（RNAi）筛选

原理：通过siRNA或shRNA库沉默细胞中的基因表达，观察活性分子的作用效果变化，鉴定靶基因。

特点：操作简便，但存在脱靶效应。

应用：适用于初步筛选潜在靶点。

3.酵母双杂交（Y2H）

原理：将活性分子的“诱饵”蛋白与酵母转录因子融合，筛选与“诱饵”蛋白相互作用的“猎物”蛋白（如cDNA文库），鉴定靶点。

特点：适用于蛋白质-蛋白质相互作用研究，但可能存在假阳性。

应用：适用于信号通路和蛋白质复合物研究。

 

三、基于化学蛋白质组学的方法

1.活性分子探针（ABPP）

原理：设计活性分子衍生物（探针），通过光交联或点击化学标记靶蛋白，结合质谱分析鉴定靶点。

特点：可捕获瞬时或弱相互作用，但探针设计需优化。

应用：适用于酶类靶点的发现和功能研究。

2.光亲和标记（PAL）

原理：在活性分子中引入光敏基团（如二苯甲酮），光照下与邻近蛋白形成共价键，结合质谱分析鉴定靶点。

特点：时空分辨率高，但光交联效率可能受限。

应用：适用于研究蛋白质-配体相互作用。

 

四、基于计算生物学的靶点预测

1.分子对接（Molecular Docking）

原理：通过计算机模拟活性分子与蛋白靶点的结合模式，预测可能的靶点。

特点：快速、低成本，但需结合实验验证。

应用：适用于初步筛选潜在靶点。

2.反向药效团匹配

原理：根据活性分子的化学结构特征，匹配已知的蛋白结合口袋，预测靶点。

特点：适用于结构明确的活性分子。

应用：辅助靶点发现和药物设计。

 

五、基于表型筛选的靶点发现

1.表型驱动筛选

原理：通过高通量筛选观察活性分子对细胞或生物体的表型影响（如分化、凋亡），结合转录组学或蛋白质组学分析，反向推断靶点。

特点：无偏性，但机制解析复杂。

应用：适用于复杂疾病模型的靶点发现。

 

六、方法选择建议

1.优先选择基于亲和力的技术（如DARTS、CETSA、BioID）

适用场景：活性分子已知，需快速鉴定直接靶点。

优势：直接、高效，适合机制研究。

2.结合遗传学筛选（如CRISPR、RNAi）

适用场景：需验证靶点的生物学功能。

优势：高通量、无偏性，适合靶点验证。

3.化学蛋白质组学方法（如ABPP、PAL）

适用场景：活性分子作用机制复杂，需捕获弱相互作用。

优势：灵敏度高，适合难溶性或低亲和力分子。

4.计算生物学辅助

适用场景：实验成本高或周期长时，缩小靶点范围。

优势：快速、低成本，但需结合实验验证。

 

七、总结

靶点发现是活性分子研究的核心环节，需根据实验目的、活性分子特性和资源条件选择合适的方法。

1.高亲和力分子：优先选择DARTS、CETSA或亲和层析。

2.弱相互作用或瞬时结合：采用BioID、ABPP或PAL。

3.无偏性筛选：结合CRISPR、RNAi或表型筛选。

4.机制验证：综合多种方法，确保结果的可靠性。

 

通过合理组合多种技术，可高效、准确地揭示活性分子的作用靶点，为后续药物开发或生物学研究奠定基础。