一、质粒提取

质粒在基因工程中已经成为一种常用且简单的载体。除了在科研领域被广泛应用外，质粒还在多类生物医药产品的研发和生产过程中发挥着重要作用，例如重组蛋白药物、疫苗、基因治疗药物以及CAR-T细胞疗法等。

    在质粒提取过程中，有时会遇到一些失败的情况。针对这些常见问题，我总结并整理了一些质粒提取过程中可能会出现的问题，并进行了详细的分析。

二、质粒提取常见问题分析

未提出质粒或质粒得率较低:
1.大肠杆菌老化:
建议在涂布平板培养后，重新挑选新的细菌菌落进行液体培养。

2.质粒拷贝数低:
可能是因为使用了拷贝数较低的质粒载体导致的。此时，可以考虑更换为具有相同功能但拷贝数较高的载体来提高提取到的质粒DNA量。

3.菌体中无质粒:
部分质粒可能无法稳定存在于特定菌株中，在多次传代后会导致质粒丢失。例如，柯斯质粒在大肠杆菌中长期保存时不稳定，因此应避免频繁传代，每次接种宜选择单菌落。另外，应检查筛选抗生素的使用浓度是否正确。
4.碱裂解不充分:
过多的菌体培养液使用会导致碱裂解不充分，可减少菌体用量或增加溶液P1、P2和P3的使用量。对于低拷贝数的质粒，在提取时可以增加溶液P1、P2和P3的使用量，有助于提高质粒提取量和质粒质量。

5.溶液使用不当
在较低温度下，溶液P2和P3可能会出现浑浊的情况，应等溶解为清亮的溶液后再使用。

6.吸附柱过载
不同产品的吸附柱吸附能力不同，若需要提取大量质粒，应分批进行提取。当使用富集培养基（如TB或2×YT）时，需减少菌液体积；若质粒或宿主菌具有高拷贝数或生长速率，则需要调整LB培养液的体积。

7.质粒未全部溶解(尤其质粒较大时)
在洗脱溶解质粒时，可适当加温或延长溶解时间。
8.乙醇残留
洗涤后应离心尽量去除残留液体，对于树脂型试剂盒，应将树脂晾干后再加入洗脱缓冲液。

9.洗脱液加入位置不正确
洗脱液应加在硅胶膜中心部位，以确保完全覆盖硅胶膜表面，从而达到最佳洗脱效果。

10.洗脱体积太小
洗脱体积会影响回收率，增大洗脱体积可提高回收率，但会降低产品浓度。为获得较高回收率，应增大洗脱体积。

11.洗脱液不合适
    洗脱液选择不当 DNA只能在低盐溶液中有效洗脱，比如洗脱缓冲液EB（含有10 mM TrisCl，pH8.5）或纯水。洗脱效率受pH值影响，最佳洗脱效率在pH7.0-8.5范围内。使用纯水进行洗脱时，确保它的pH值在此范围内，若pH过低可能导致洗脱效果不佳。将灭菌蒸馏水或洗脱缓冲液加热至60°C后使用，有助于提高洗脱效率。

12.洗脱时间过短
洗脱时间也会对回收率产生一定影响。建议将洗脱物悬浮在洗脱液中放置一分钟可获得更好的效果，确保充分洗脱。

质粒纯度不高:
1.混有蛋白
首先要避免使用过多菌体。在使用溶液P1、P2、P3进行处理并离心后，确保溶液应该呈现澄清状态。如果仍然存在微小蛋白悬浮物，可再次进行离心去除后再进行下一步操作。
2.混有RNA
可能是由于RNase A处理不彻底所致。此时建议减少菌体使用量或是在加入溶液P3后将其静置在室温下一段时间。另外，如果溶液P1保存时间超过6个月，建议在其中添加RNase A以确保对RNA的彻底降解。

3.混有基因组DNA
加入溶液P2和P3后，应轻柔混合。剧烈振荡可能导致基因组DNA被切割成碎片，并与质粒混合。如果在加入溶液P2后出现过于黏稠，无法轻柔混合的情况，请减少菌体用量。细菌培养时间过长会导致细胞和DNA的降解，建议不要超过16小时。

4.P3溶液加入时间过长
在添加P3溶液后，避免过长的存放时间，以免产生小片段DNA污染。
5.含大量核酸酶的宿主菌
宿主菌含有大量核酸酶可能在质粒提取过程中降解质粒DNA，影响质粒DNA的完整性。建议选择不含核酸酶的大肠杆菌宿主菌，例如DH5α和Top10。

6.裂解时间过长
加入溶液P2后，裂解时间不应超过5分钟。过长的裂解时间可能会对DNA的提取产生不利影响。