实时荧光定量 PCR（QPCR）是一种常用的分子生物学技术，用于检测特定核酸序列的含量。内标在 QPCR 中起着重要的作用，它可以帮助校正样本间的差异，提高实验的准确性和重复性。然而，在实际操作中，有时会出现内标异常的情况，这可能会影响实验结果的可靠性。
本文将对 QPCR 内标异常的几个具体案例进行详细解析。
一、内标未起线（无扩增）
现象描述
在一次新冠病毒核酸检测中，多个样本的内源性内标（如RNase P）未出现扩增曲线，即内标未起线。而阳性对照和阴性对照均正常，表明实验体系本身无重大问题。
原因分析
1.样本漏加或加样错误：在加样过程中可能存在漏加样本或加错样本的情况，导致这些样本的内标无法扩增。
2.采样管问题：采样管保存液变质，出现沉淀或液体变浑浊，影响样本质量，从而导致内标无法扩增。
3.提取步骤问题：提取过程中可能存在操作不当或试剂污染，导致提取的核酸质量不佳，无法用于后续扩增。
解决方案
1.检查加样步骤：回顾加样过程，确认是否有漏加或加错样本的情况。
2.更换采样管：使用质量可靠的采样管，并检查采样管保存液的状态，避免使用变质或污染的采样管。
3.优化提取步骤：优化提取方法，确保提取过程中无抑制物残留，并使用高质量的提取试剂和耗材。
二、内标Ct值异常偏高
现象描述
在QPCR实验中，部分样本的内标Ct值异常偏高，远高于正常值范围。这些样本的阳性靶标扩增曲线正常，但内标扩增效率明显偏低。
原因分析
1.样本中存在抑制物：样本中可能存在某些抑制物（如多糖、蛋白质、脂肪等），这些抑制物会干扰PCR扩增反应，导致内标扩增效率降低。
2.提取不完全：核酸提取过程中可能存在提取不完全的情况，导致提取的核酸量不足，内标扩增效率降低。
3.引物问题：内标引物的设计或质量可能存在问题，如引物特异性不高、纯度不够等，影响内标的扩增效率。
解决方案
1.样本稀释：将样本稀释后重新进行提取和扩增，以降低抑制物的影响。
2.优化提取方法：优化提取步骤，确保提取完全，并使用高质量的提取试剂和耗材。
3.更换引物：重新设计或选择高质量的内标引物，并进行验证实验以确认其特异性和扩增效率。
三、内标扩增曲线异常（非典型S型）
现象描述
在QPCR实验中，部分样本的内标扩增曲线呈现非典型S型，如曲线不平滑、有波动或翘尾等现象。
原因分析
1.温度控制不稳定：qPCR仪的温度控制可能存在不稳定的情况，导致扩增过程中温度波动较大，影响扩增曲线的形态。
2.反应体系污染：反应体系中可能存在污染物（如DNA片段、引物二聚体等），导致非特异性扩增或扩增抑制。
3.仪器故障：qPCR仪本身可能存在故障或老化现象，导致检测结果不准确。
解决方案
1.检查温度控制：检查qPCR仪的温度控制系统是否稳定可靠，必要时进行校准或维修。
2.优化反应体系：优化反应体系中的各组分浓度和纯度，减少污染物的干扰。同时，注意操作规范，避免交叉污染。
3.更换仪器：如果qPCR仪存在严重故障或老化现象且无法修复，建议更换新的仪器以确保检测结果的准确性。
四、内标扩增曲线翘尾
现象描述
在QPCR实验过程中，观察到部分样本的内标扩增曲线在后期出现翘尾现象，即扩增曲线在达到平台期后继续上升，形成尾部上翘的形状。
原因分析
1.污染：实验过程中可能存在交叉污染或气溶胶污染，导致非特异性扩增产物的形成，从而在扩增后期出现翘尾现象。
2.引物问题：内标引物的设计可能不够特异性，或者引物浓度过高，导致在扩增后期出现非特异性扩增。
3.样本问题：样本中可能存在某些未知成分或抑制物，这些成分在扩增过程中与引物结合形成非特异性扩增产物。
解决方案
1.加强污染控制：严格遵守实验室操作规范，定期清洁实验室和仪器设备，避免交叉污染和气溶胶污染。
2.优化引物设计：重新设计或选择特异性更高的内标引物，并调整引物浓度至适宜范围。
3.样本处理：对样本进行适当处理，如稀释、纯化等，以减少未知成分或抑制物的影响。
五、内标扩增曲线不规则波动
现象描述
在QPCR实验过程中，部分样本的内标扩增曲线呈现不规则波动形状，即扩增曲线在扩增过程中频繁上下波动，无法形成平滑的S型曲线。
原因分析
1.温度波动：qPCR仪的温度控制系统可能存在问题，导致扩增过程中温度波动较大，影响扩增曲线的形态。
2.反应体系不均一：各反应管中的反应体系组分可能存在不均一性，如酶活性差异、引物浓度差异等，导致扩增效率不一致。
3.操作不当：在加样或混合反应体系时可能存在操作不当的情况，如加样不均匀、混合不充分等，导致扩增曲线波动。
解决方案
1.检查仪器：定期检查qPCR仪的温度控制系统是否稳定可靠，必要时进行校准或维修。
2.优化反应体系：确保各反应管中的反应体系组分均一性良好，如使用同一批次的试剂、严格控制加样量等。
3.规范操作：加强实验人员的培训和管理，确保操作规范、准确。在加样和混合反应体系时要特别注意均匀性和充分性。
六、内标扩增曲线整体偏低
现象描述
在QPCR实验过程中，部分样本的内标扩增曲线整体偏低，即Ct值明显高于正常值范围，且扩增曲线斜率较小。
原因分析
1.样本质量差：样本中可能存在降解、污染或含量不足的情况，导致提取的核酸质量不佳或浓度过低。
2.提取效率低：核酸提取过程中可能存在提取效率不高的情况，如提取方法不当、提取试剂质量不佳等。
3.反应体系抑制：反应体系中可能存在某些抑制物（如多糖、蛋白质等），这些抑制物会干扰PCR扩增反应导致扩增效率降低。
解决方案
1.改善样本质量：确保采集到的样本质量良好无降解和污染情况，并适当提高样本采集量以增加核酸含量。
2.优化提取方法：优化核酸提取方法以提高提取效率，并选用高质量的提取试剂和耗材。
3.去除抑制物：在反应体系中加入适量的抑制物去除剂或使用特殊的提取方法以减少抑制物的影响。
