脾细胞是ELISpot和FluoroSpot测定中使用最多的细胞，至少对小鼠和大鼠样本而言是如此。脾细胞可以很容易地从脾脏中分离出来，而不需要Ficoll分离。细胞可以在分离后直接使用，也可以冷冻保存，并在以后批量使用。

一、脾细胞的分离

材料

1.细胞过滤器，70µm尼龙，无菌

2.无菌剪刀和镊子或镊子

3.无菌培养皿

4.巴氏移液管，无菌

5.无菌注射器，3毫升或5毫升（无针）

6.聚丙烯离心管：15ml，无菌

7.培养基：RPMI1640，已添加100µg/mL青霉素+100µg/mL链霉素

步骤

1.把脾脏倒进培养皿里。如有需要，使用剪刀、镊子或镊子去除多余的脂肪和组织。

2.将细胞滤网放入新的培养皿中，将脾脏转移到滤网中。加入5毫升培养基。

3.使用注射器的扁平柱塞端，通过细胞过滤器将脾脏匀浆到培养皿中。

4.用5ml培养基将细胞滤网中的细胞冲洗到培养皿中。

5.将脾细胞从培养皿转移到15ml离心管中。

6.将试管静置一分钟，让大块沉淀物沉淀或使用无菌巴斯德移液管去除团块和粘连体。将脾细胞悬浮液转移到新的15ml离心管中，再加入培养基重悬。

7.以300xg离心10分钟。

8.去除上清并将细胞沉淀重悬于15ml培养基中。

9.记下体积，取一小份进行细胞计数。

10.以300xg离心10分钟。（提示：在此步骤中对细胞进行计数）

11.如果要立即使用细胞，则去除上清后，并通过轻轻吹打将细胞沉淀重悬于细胞培养基中，就可以用于基于细胞的免疫测定，如ELISpot、FluoroSpot和流式细胞术。如果需要冻存细胞，则进入下一步。

 

二、脾细胞的冻存

材料

1.冷冻培养基：RPMI1640（含2mM L-谷氨酰胺），+20%FCS和10%DMSO。如果细胞使用的是无血清培养基，请使用 7%DMSO

2.冷冻容器，例如“CoolCell”或“Mr.结霜”

3.聚丙烯离心管：50mL和/或15mL，无菌

4.自动移液器和无菌吸头

5.冻存管，例如1.8mL

6.-80℃冰柜

7.-150℃冰柜或液氮罐

步骤

1.接着上一节第11步，去上清，在冷冻培养基中将细胞稀释至浓度为5-2500万个细胞/ml。如果您使用的是无血清冷冻培养基，则使细胞浓度达到100万个细胞/ml。

2.分装，例如，每支冻存管中分1 mL，并将冻存管转移至冷冻容器中。确保通过不断重悬使细胞保持悬浮状态。

3.迅速将冷冻容器置于-80℃冰箱中，并储存至少4小时，最多1周。

4.将冻存管从冷冻容器中转移至-150℃冰箱或液氮罐中长期储存。

 

三、脾细胞的复苏

材料

1.细胞培养基：RPMI 1640（含2mML-谷氨酰胺）+ 10%FCS、10mM HEPES和100µg/mL青霉素 + 100µg/mL链霉素

2.37℃水浴

3.聚丙烯离心管：50mL和/或15mL，无菌

4.移液器和移液器男孩

5.自动移液器和无菌吸头

6.室温离心机

7.CO2培养箱 (37°C)

步骤

1.将冻存管从冷冻库中迅速转移至37℃水浴中，解冻细胞，直至仅剩余少量冰晶。

2.向冻存管中缓慢加入0.5-1mL细胞培养基，重悬细胞，并从冻存管中转移至15mL 试管中。用1mL 细胞培养基冲洗冻存管，并将剩余细胞继续转移至 15mL试管中。最后再向试管中加入更多的细胞培养基。

3.以300xg离心10min。

4.去上清，轻拍试管，使沉淀物不那么致密。通过缓慢上下吸液，将细胞重悬于1mL 细胞培养基中。加入细胞培养基至总体积为15mL。

5.以300xg 离心10min。

6.去上清，将沉淀重悬于1mL 细胞培养基中。添加更多的细胞培养基（例如，5mL，取决于预期的细胞数量和所需的细胞浓度）。

7.将细胞置于CO2培养箱中1小时。保持瓶盖略微打开。（冻存培养基含有对细胞有毒性的DMSO，如果你要复苏多管，建议少拿几管操作，需尽快从第1步进到第2步）。

8.孵育后，重悬细胞，并使聚集的细胞碎片或团块沉淀（大约需要 min）。然后小心地将没有碎片的细胞悬液转移到新的15mL试管中。

9.计数细胞并测定细胞活力。可使用自动细胞计数器或使用显微镜的台盼蓝染色进行计数。如果细胞浓度低于所需浓度，再次离心细胞，重悬并稀释至正确体积。