一、引言
蛋白质是细胞结构和功能的核心执行者，在生物学研究中，蛋白提取是研究其功能、结构及相互作用的基础步骤。无论是用于Western Blot、酶活性检测，还是质谱分析，提取到高质量、完整的蛋白质都是确保实验结果准确性的前提。
在蛋白提取过程中，弃上清吸取法 是一种非常常见且高效的方法。这种方法通过离心后丢弃上清液，保留含有蛋白的沉淀或上清部分，适用于多种类型的样本，如细胞和组织。该方法尤其在蛋白样品含量较低时，能最大限度地减少样品损失并提高提取效率。
二、 实验前准备
在进行蛋白提取实验之前，准备好必需的试剂和设备是关键。不同样本类型的提取需求可能不同，因此在实验前的准备工作需要仔细规划。
1.关键试剂与设备：
裂解液：裂解液的选择直接决定了蛋白提取的效率和稳定性。常用的裂解液包括RIPA、NP-40、SDS等，每种裂解液对不同细胞成分的提取效率有所不同。例如，RIPA裂解液对膜蛋白和细胞质蛋白提取效果较好。
蛋白酶抑制剂：为了防止蛋白在提取过程中被降解，加入蛋白酶抑制剂至关重要。推荐使用广谱蛋白酶抑制剂，并在实验前现配现用。
离心机：高速离心是分离蛋白和细胞碎片的关键步骤。确保离心机的温度控制良好，避免高温导致蛋白降解。
移液器与无菌吸头：在吸取上清时，精准的移液操作可以减少样本损失和污染，因此要确保移液器校准正常，吸头洁净无菌。
2.样本准备差异：
细胞样本：对于贴壁细胞或悬浮细胞，裂解前需要先通过PBS洗涤去除培养基中的成分。细胞密度应适中，避免细胞量过多导致裂解不充分。
组织样本：组织样本在裂解时需先进行机械匀浆（如使用Dounce匀浆器），确保充分裂解。此外，使用强力裂解液（如含SDS的裂解液）可能有助于提高蛋白提取率。
蛋白提取环境的影响：蛋白提取过程中，温度 是影响蛋白质稳定性的重要因素。建议在 4°C 条件下进行裂解、离心操作。此外，保持低温有助于防止蛋白酶活性过高，减少蛋白降解风险。
三、弃上清吸取法的详细步骤
在蛋白提取的过程中，弃上清吸取法通过离心将样品中的细胞碎片与蛋白质分离，从而获得含有目标蛋白的上清液或沉淀。以下是详细的操作步骤：
1.裂解
细胞裂解：细胞样本可以通过RIPA或NP-40裂解液进行裂解。首先，使用适量裂解液悬浮细胞或洗涤后的贴壁细胞，轻轻吹打以促进细胞破裂。如果裂解效率较低，可以在冰上孵育10-20分钟，期间每隔几分钟轻轻震荡样品，确保裂解完全。
组织裂解：对于组织样本，需先将样本切割成小块，加入裂解液后进行匀浆处理。确保使用足量裂解液以覆盖样本，并在冰上孵育一段时间。
2.离心
高速离心 是蛋白提取过程中至关重要的一步，通常在 12,000-14,000g 的高速下进行离心15-20分钟。离心时，样品温度应控制在4°C，避免蛋白在离心过程中发生降解。
注意事项：确保离心管平衡，避免离心时样品发生倾斜，导致蛋白沉淀不完全。离心过程中应尽量减少振动，以免影响分层效果。
3.吸取上清
离心后，蛋白质会根据其溶解性质存在于上清液或沉淀中。对于大多数细胞质蛋白，目标蛋白通常位于上清中。因此，操作时应小心吸取上清，确保不干扰蛋白沉淀层。
精准吸取上清：使用移液器吸取上清时，应缓慢且稳定地操作，避免误吸沉淀部分。如果上清体积较小，建议使用微量吸头（如200µL吸头）进行吸取，确保最大限度减少样本损失。
避免扰动沉淀：在吸取上清时，尤其是在蛋白沉淀明显的情况下，应特别注意不要触碰到沉淀层。如果目标蛋白在沉淀中，应吸取上清后保留沉淀部分以供进一步操作。
4.保存与储存
提取蛋白后，建议立即使用部分样本进行定量测试，以确定蛋白浓度。未立即使用的蛋白样品可以储存。
短期保存：短期保存（1-2天）时，蛋白可以储存在4°C，并在样品中加入蛋白酶抑制剂以防止降解。
长期保存：如果需要长期保存，建议将蛋白样品分装后置于 -20°C 或 -80°C，避免反复冻融。每次取用样品时，尽量使用已经分装的小体积样品，减少对整体样品的损伤。
四、实验中的小Tips：优化蛋白提取效果
在蛋白提取过程中，有许多细节操作可以显著提高提取效率并保证蛋白的完整性。以下是一些有助于优化蛋白提取的小技巧（Tips），帮助科研人员在实验中获得更好的结果。
1.如何选择合适的裂解液，提升蛋白提取率
不同的裂解液对于细胞和组织的蛋白提取效率差异很大，选择合适的裂解液能显著提高提取率。常用的裂解液包括RIPA、NP-40、SDS等，每种裂解液都有其独特的成分配方，适合不同类型的蛋白质提取。
RIPA裂解液：广泛用于细胞质蛋白和膜蛋白的提取，适用于大多数常规实验，但对某些细胞器蛋白提取效果不佳。
NP-40裂解液：较为温和，适合提取不易溶解的膜蛋白，但如果蛋白是高度结构化或含大量疏水区域，可能需要更强效的裂解液。
SDS裂解液：强效去污剂，适合提取难溶的蛋白，如核蛋白和某些高度聚集的膜蛋白。
如何选择：如果目标蛋白是细胞质蛋白，RIPA裂解液通常是首选；对于膜蛋白和细胞器蛋白，NP-40或SDS裂解液可能更有效。此外，根据实验需求，可以选择含有磷酸酶和蛋白酶抑制剂的裂解液配方，防止蛋白降解。
2.离心时如何避免蛋白丢失，保持蛋白完整性
离心是蛋白提取过程中关键的一步，用于分离细胞碎片和蛋白质。操作不当可能导致蛋白丢失或样品损坏，因此确保适当的离心条件非常重要。
离心时间和速度：通常蛋白提取过程中需要高速离心（12,000-14,000g），时间控制在15-20分钟。速度过低可能无法完全分离出细胞碎片，而速度过高可能会引起蛋白沉淀变硬或蛋白质分解。提前校准离心机，并确保样品在4°C 条件下进行，以防止蛋白降解。
离心管平衡：确保所有离心管在离心前重量平衡，避免因不平衡引起的设备震动，这不仅可能损坏离心机，还会影响分离效果。
缓慢处理上清：离心后蛋白往往在上清中，操作时应轻柔吸取上清，避免扰动沉淀层。使用多道移液器或微量移液器可以更好地控制上清吸取。
3.正确使用移液器吸取上清，避免扰动蛋白沉淀
移液器的使用技巧直接关系到样品的纯度和实验的成功率。吸取上清时，操作不当容易导致沉淀被扰动，影响蛋白的分离效果。
吸取技巧：吸取上清时，建议使用 200µL 或更小的移液器吸头，控制液面深度，轻柔吸取。将移液器吸头放置在液面附近，而不是深入到沉淀层，以确保最大限度地保留蛋白沉淀。
避免气泡：吸取时，应避免产生气泡，因为气泡可能扰动沉淀层，影响上清的分离效果。缓慢调整吸头的移动速度和角度可以减少气泡产生的几率。
4.确保蛋白在提取和保存过程中维持最佳活性
提取后的蛋白如果保存不当，容易发生降解或失活，影响后续实验。以下几点是确保蛋白质活性和稳定性的关键：
保持低温：蛋白质对温度敏感，尤其是在离心和保存阶段。因此，尽量在 4°C 或 冰浴 条件下进行裂解和操作。对于长期保存，建议将蛋白分装后保存在 -20°C 或 -80°C，避免反复冻融。
加入保护剂：蛋白提取时加入蛋白酶抑制剂可以有效减少蛋白酶对蛋白质的降解。对于部分敏感蛋白，可以考虑加入甘油或二硫苏糖醇（DTT），以保持蛋白质的溶解性和活性。
五、 常见问题与解决方案
蛋白提取过程是一个相对复杂的操作，科研人员常常遇到蛋白浓度低、蛋白降解等问题。
以下是一些常见问题的分析和解决方案。
1.蛋白浓度低
原因分析：蛋白浓度低通常是由于裂解不充分、样本量过少或离心后蛋白丢失导致的。
解决方案：
优化裂解条件：确保样本充分裂解，可以增加裂解液的量，或延长裂解时间（例如在冰上孵育20-30分钟），同时不断轻柔振荡样品以促进裂解。
增加样本量：如果样本本身含有较低的蛋白质量，建议增加初始样本的量，特别是组织样本时。
减少蛋白丢失：确保离心后吸取上清时，不遗漏上清中的蛋白质部分。如果蛋白在沉淀中，可以在重新悬浮沉淀时轻轻震荡，使蛋白质重新溶解。
2.蛋白降解
原因分析：蛋白降解可能是由于样本裂解时间过长或温度过高、未及时加入蛋白酶抑制剂等原因导致。
解决方案：
加入蛋白酶抑制剂：提前准备好新鲜的蛋白酶抑制剂，确保在裂解液中添加足量的抑制剂以防止蛋白在提取过程中降解。
控制温度：确保所有操作在 低温 下进行。无论是裂解、离心还是储存阶段，都要保持样本处于4°C或更低的温度。
3.蛋白提取后无法检测
原因分析：有时提取的蛋白在后续检测中无法检测到，可能是由于提取步骤中的某个环节出了问题，如离心不彻底、蛋白过度降解或上清吸取错误。
解决方案：
复查离心条件：检查离心时间和速度是否足够分离出蛋白质。如果离心条件不足，可能导致蛋白质仍与细胞碎片混在一起。
定量蛋白：使用BCA或Bradford蛋白定量法，在检测前确定蛋白浓度，确保样品中含有足够的蛋白质。
六、总结与注意事项
弃上清吸取法 是一种高效的蛋白提取方法，通过优化操作步骤和注意实验细节，可以显著提升实验结果的可靠性。
总结而言，以下几点需要特别注意：
1.关键步骤：包括裂解液的选择、离心速度与时间的控制、上清液的精确吸取等，每一步的优化都对提取效果至关重要。
2.常见错误：实验中可能出现样本裂解不充分、蛋白降解或上清吸取不当等问题。提前预防并及时解决这些问题，可以确保实验顺利进行。
3.蛋白保存与稳定性：在蛋白质提取和保存过程中，保持低温和加入蛋白酶抑制剂至关重要，确保蛋白质活性不受影响。
通过优化这些步骤，科研人员可以在蛋白提取过程中减少误差，获得稳定、可靠的蛋白样本，为后续实验（如Western Blot、酶活性检测等）打下坚实基础。
