一、避免分化的方法
1.控制细胞密度
传代密度：RAW264.7细胞喜欢高密度生长，推荐在细胞密度达到80%-90%时进行传代，避免细胞密度过低导致生长缓慢或分化。
接种密度：复苏时细胞数量控制在1.0×10⁶-1.5×10⁶个/皿（直径6cm），避免复苏密度过高或过低。
2.优化培养条件
培养基：使用高质量的胎牛血清（FBS），推荐培养基配方为90% DMEM + 10% FBS + 青霉素/链霉素（PS）。
温度与CO₂：维持37℃、5% CO₂的培养环境。
培养器皿：推荐使用T25培养瓶，避免直接使用大皿（如T75）复苏细胞。
3.传代方法
避免胰酶消化：RAW264.7细胞对胰酶敏感，消化后易分化，推荐使用以下方法：
吹打传代：用移液枪或巴氏管轻轻吹打细胞，将未分化的圆形细胞吹下并转移至新培养瓶。
细胞刮刀传代：使用无菌细胞刮刀轻轻刮下细胞，收集后离心重悬。
传代比例：推荐1:2至1:3的比例传代，避免细胞过度稀释。
4.控制培养时间
传代间隔：RAW264.7细胞生长速度快，一般2-3天需传代一次，避免超过3天，否则细胞易分化。
观察细胞形态：当细胞出现伪足或形态变为四角形时，需及时传代。
5.避免过度刺激
减少抗原暴露：RAW264.7细胞具有强吞噬能力，吞噬过多抗原会促进分化，需避免培养环境中抗原过多。
避免使用LPS等激活剂：LPS等外源性刺激剂会诱导细胞分化，需控制其浓度和时间。
二、培养注意事项
1.复苏操作
快速解冻：将冻存管在37℃水浴中快速摇晃解冻（约1分钟），避免细胞受损。
离心去上清：解冻后加入4mL培养基混合均匀，1000 rpm离心3分钟，弃去上清液，用1-2mL培养基重悬细胞。
培养过夜：将细胞悬液加入含适量培养基的培养瓶中，置于37℃、5% CO₂培养箱中培养过夜，第二天观察细胞状态。
2.传代操作
弃去上清：传代时先弃去培养上清，用PBS润洗细胞1次。
轻轻吹打：加入2mL预冷的PBS，轻轻吹下细胞，收集到无菌离心管中，1000 rpm离心5分钟，弃去上清液。
重悬接种：用1-2mL培养液重悬细胞，按1:2比例分到新的培养瓶中，置于培养箱中培养。
3.冻存操作
细胞收集：待细胞生长状态良好时，收集细胞并离心，弃去上清液，用PBS清洗一遍。
冻存液重悬：根据细胞数量加入无血清细胞冻存液，调整细胞密度为5×10⁶-1×10⁷个/mL，轻轻混匀。
分装冻存：将细胞悬液按1mL/管分装至冻存管中，标识代数、日期，放入-80℃冰箱，24小时后转入液氮罐储存。
三、其他注意事项
1.避免污染：与细胞接触的玻璃器皿需高温灭菌，培养过程中注意无菌操作。
2.定期观察：每天观察细胞形态和生长状态，记录细胞生长规律。
3.支原体检测：定期进行支原体检测，如发现污染，立即使用支原体去除试剂处理。
