亲爱的小伙伴们，大家好！在实验室工作中，转膜是一个非常重要的步骤。那么，转膜技巧的关键你知道是什么吗？
首先，选择合适的膜是关键之一。不同的膜具有不同的特点，需要根据实验的具体需求进行选择。转移分子量小于20kDa的蛋白时建议使用小孔径的膜 (如0.22μm)，正常情况下使用0.45μm孔径的膜即可。
其次，正确的缓冲液配制也至关重要。它会影响到蛋白的转移效果。转膜过程会伴随严重的发热现象，建议提前配好缓冲液并在4 ℃冰箱进行预冷。建议在4 ℃条件下进行转膜，或在电泳槽的周围放冰块或冰袋，进行冰水浴以达到降温目的。
再者，蛋白浓度和样本处理也需要注意。过高或过低的蛋白浓度都可能影响实验结果。
另外，转膜的时间和条件也需要严格控制。过长或过短的时间，以及不合适的条件都可能导致转膜失败。
具体的操作步骤：
1.裁减适当大小的6张滤纸（比胶大，比海绵层小都可以），放入上述大皿中，使其浸湿；
2.裁减同胶一样大的硝酸纤维素膜（用白色纸保护的），放入上述大皿中，使其浸湿；
3.将转移器材打开，黑色一面对着自己，将海绵浸湿，覆盖在黑面上，俩手拿着一张滤纸的上沿将滤纸提起，从另一端起，慢慢将滤纸放在海绵上，注意两者之间不要产生气泡，如有气泡，用一根试管加点blotting buffer，然后滚动着将气泡赶去，如上再放上两片滤纸，总共三层；
4.之后，将胶以放滤纸的方法放在滤纸上，如果胶的边缘部分有些卷边，则可以用刀片切去一小部分。同样注意不要产生气泡；
5.在胶的一个角上用铅笔做上标记，以表示其为正面，并说明膜的内容，双手提起膜，将做标记的一面向下，由下向上缓慢将膜覆盖在胶上，去除两者之间的气泡；
6.同2中的方法放上三张滤纸，盖上海绵，再将转移盒合上；
7.将转移盒放入转移槽中，黑靠黑，白靠红，将大皿中的blotting buffer倒入其中，如不足，可再加入瓶中的blotting buffer，直至覆盖住胶和膜所在的位置。最后检查一遍电极正负是否正确：蛋白质带负电荷，从负极向正极走，即胶——膜对应于负极——正极。
8.电转移：
a.4 ℃，40mA，overnight（10-12h）
b.4 ℃（冰水浴），300mA，1.5h。（电流大小克随蛋白增大而增大）
在实际操作中，还需要注意以下几点：
1.要避免产生气泡，气泡会影响转膜效果。
2.膜的处理和保存也需要格外小心，不要徒手拿凝胶和PVDF膜。手指上的油脂和分泌物不仅会在显色后出现痕迹，干扰判定，而且还会封闭转移膜，阻止蛋白质从凝胶转向PVDF膜。
3.转膜过程应该迅速，以防止蛋白条带的扩散，同时要确保膜和凝胶保持湿润
最后，我们还需要知道一些常见问题及解决方法。例如，如果转膜效果不佳，可以检查膜的选择、缓冲液配制、蛋白浓度等方面是否存在问题。
掌握转膜技巧的关键，可以让我们的实验更加顺利，得到更加准确的实验结果。希望大家都能够重视转膜技巧，不断探索和优化。
