一、操作步骤
1.细胞复苏
从液氮罐中取出冻存管，迅速放入37℃水浴中轻轻摇动，使其尽快融化。
融化后，将细胞悬液转移至离心管中，加入适量的完全培养基，1000rpm离心5分钟，弃去上清液。
用新鲜完全培养基重悬细胞，接种到培养瓶中，置于37℃、5% CO₂的培养箱中培养。
2.细胞传代
当细胞密度达到80%-90%时，进行传代。
吸除旧培养基，用PBS洗涤细胞一次。
加入适量的0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液，轻轻晃动培养瓶，使胰蛋白酶均匀覆盖细胞层。
放入37℃培养箱中孵育1-2分钟，显微镜下观察细胞变圆、间隙增大时，加入完全培养基终止消化。
轻轻吹打细胞，使其脱落并分散成单细胞悬液。
将细胞悬液按1:2至1:4的比例接种到新的培养瓶中，补足培养基，继续培养。
3.细胞换液
每隔2-3天更换一次培养基，以保持细胞的健康生长。
吸除旧培养基，用PBS洗涤细胞一次，加入新鲜完全培养基。
4.细胞冻存
选择生长状态良好的细胞，冻存前一天更换新鲜培养基。
消化细胞，收集细胞悬液，1000rpm离心5分钟，弃去上清液。
用冻存液（含10% DMSO、10%-20% FBS的完全培养基）重悬细胞，调节细胞浓度至1×10⁶个/mL。
将细胞悬液分装到冻存管中，放入程序降温盒中，-80℃过夜，然后转移至液氮罐中长期保存。
二、注意事项
1.无菌操作
实验前，将细胞房和生物安全柜用紫外照射30分钟进行灭菌。
实验过程中，严格遵守无菌操作规范，避免细胞污染。
所有使用的耗材和试剂必须经过灭菌处理，操作时避免接触培养瓶口和细胞悬液。
2.培养基的配制与使用
MIN6细胞推荐使用RPMI-1640培养基，含10%胎牛血清（FBS）、1%青霉素-链霉素（P/S）和50μM β-巯基乙醇。
培养基需提前从冰箱取出，恢复至室温或37℃后再使用。
定期检查培养基的pH值，确保其在7.2-7.4之间。
3.细胞形态与生长状态观察
MIN6细胞为不规则上皮细胞样，贴壁生长。
每天显微镜下观察细胞的生长状态，包括细胞形态、密度和贴壁情况。
若发现细胞生长缓慢、形态异常或污染，需及时调整培养条件或更换细胞。
4.传代与消化时间控制
MIN6细胞传代比例一般为1:2至1:4，传代周期为2-3天。
消化细胞时，需严格控制胰蛋白酶的消化时间和浓度，避免消化过度或不足。
消化过程中，可在显微镜下观察细胞状态，确保细胞变圆但未完全脱落时终止消化。
5.培养环境的维持
细胞培养箱需保持37℃、5% CO₂的恒定环境。
定期检查培养箱的CO₂浓度和温度，确保其稳定。
培养瓶的瓶盖需拧松或使用透气瓶盖，以保证气体交换。
6.细胞污染的预防与处理
若发现细胞污染，需立即处理。对于细菌污染，可尝试使用抗生素处理；对于真菌或支原体污染，建议丢弃污染细胞，重新复苏细胞。
实验过程中，避免频繁打开培养箱门，减少污染风险。
7.其他注意事项
MIN6细胞贴壁性较差，培养过程中可能会有少量细胞漂浮，属于正常现象。
若细胞漂浮较多，可在培养瓶或孔板表面涂布多聚赖氨酸，以增强细胞贴壁能力。
实验过程中，需详细记录细胞的培养条件、传代次数和生长状态，以便后续分析和追溯。
