一、蛋白质结构的层次

蛋白质的结构按复杂程度可分为以下四个层次：

1. 一级结构（Primary Structure）

定义：蛋白质中氨基酸的线性排列顺序，由肽键连接形成多肽链。

重要性：一级结构是蛋白质功能的基础，决定了高级结构的形成。

示例：胰岛素由51个氨基酸组成，其一级结构中包含两个二硫键连接的肽链（A链和B链）。

2. 二级结构（Secondary Structure）

定义：多肽链中局部主链原子的空间排布，不涉及侧链构象。

主要类型：

α-螺旋：右手螺旋结构，每圈含3.6个氨基酸残基，氢键稳定。

β-折叠：多肽链平行或反平行排列，通过氢键形成片层结构。

无规卷曲：无固定规律的多肽链构象。

示例：角蛋白富含α-螺旋，丝心蛋白富含β-折叠。

3. 三级结构（Tertiary Structure）

定义：整条多肽链中所有原子的空间排布，包括主链和侧链。

稳定因素：疏水相互作用、氢键、离子键、二硫键和范德华力。

示例：肌红蛋白具有8段α-螺旋，通过疏水核心和二硫键稳定其三级结构。

4. 四级结构（Quaternary Structure）

定义：由两条或多条多肽链（亚基）组成的蛋白质中，亚基之间的空间排布和相互作用。

稳定因素：亚基间的非共价相互作用（如氢键、离子键、疏水作用）。

示例：血红蛋白由四个亚基（2个α链和2个β链）组成，具有协同结合氧气的功能。

 

二、蛋白质结构的测定方法

不同层次的蛋白质结构需要采用不同的实验或计算方法进行测定。以下是常用的测定技术及其原理：

1. 一级结构测定方法

Edman降解法：

原理：通过逐步化学降解，从N端依次识别氨基酸残基。

步骤：

蛋白质与异硫氰酸苯酯（PITC）反应，形成苯氨基硫甲酰（PTC）衍生物。

酸处理使PTC-肽链断裂，释放N端氨基酸的噻唑啉酮苯胺（ATZ）衍生物。

转化为稳定的苯乙内酰硫脲（PTH）氨基酸，通过色谱鉴定。

剩余肽链循环进行降解。

局限性：对长链蛋白效率低，且N端封闭的蛋白无法测定。

质谱法（MS）：

原理：通过测量肽段离子的质荷比（m/z），结合数据库搜索或从头测序（de novo sequencing）推断氨基酸序列。

优势：高通量、高灵敏度，适用于复杂样品和长链蛋白。

基因测序法：

原理：通过测定编码蛋白质的基因序列，推导氨基酸序列。

应用：常用于已知基因的蛋白质序列验证。

2. 二级结构测定方法

圆二色光谱（CD）：

原理：利用手性分子对左旋和右旋圆偏振光吸收差异，测定蛋白质中α-螺旋、β-折叠等二级结构的含量。

优势：快速、无损，适用于溶液状态下的蛋白质。

傅里叶变换红外光谱（FTIR）：

原理：通过检测蛋白质中化学键的振动频率，分析二级结构组成。

应用：与CD互补，适用于膜蛋白等难结晶蛋白。

3. 三级结构测定方法

X射线晶体学（X-ray Crystallography）：

原理：通过X射线衍射解析蛋白质晶体的电子密度图，构建原子模型。

步骤：

蛋白质结晶。

收集X射线衍射数据。

解析相位问题（常用方法：多对同晶置换法、反常散射法）。

构建和优化蛋白质模型。

优势：分辨率高（可达原子级别），是解析高分辨率结构的主要方法。

局限性：结晶困难，耗时长。

核磁共振光谱（NMR）：

原理：利用原子核在外加磁场中的共振现象，测定蛋白质中原子间的距离和角度，构建三维结构。

优势：适用于溶液状态下的蛋白质，可研究动态结构。

局限性：分子量限制（通常<50 kDa），数据解析复杂。

冷冻电子显微镜（Cryo-EM）：

原理：在低温下对蛋白质样品进行电子显微成像，通过图像处理和三维重构解析结构。

优势：无需结晶，适用于大分子复合物和膜蛋白。

发展：近年来技术突破（如直接电子探测器、单颗粒分析），分辨率大幅提升。

4. 四级结构测定方法

X射线晶体学、NMR和Cryo-EM：

四级结构的测定方法与三级结构类似，但需关注亚基间的相互作用。

示例：通过Cryo-EM解析的核孔复合物结构，揭示了其由多个亚基组成的复杂四级结构。

小角X射线散射（SAXS）：

原理：通过测量蛋白质在溶液中的散射强度，分析其整体形状和大小。

应用：适用于柔性或动态的蛋白质复合物。

5. 计算预测方法

同源建模（Homology Modeling）：

原理：基于已知结构的同源蛋白，通过序列比对和结构比对预测目标蛋白的结构。

工具：SWISS-MODEL、MODELLER。

从头预测（Ab Initio Prediction）：

原理：基于物理化学原理和统计势能函数，直接预测蛋白质结构。

工具：Rosetta、QUARK。

深度学习辅助预测：

工具：AlphaFold、RoseTTAFold等，利用深度学习算法大幅提高结构预测精度。

应用：在2020年CASP14竞赛中，AlphaFold2实现了接近实验精度的结构预测。

 

三、总结：蛋白质结构研究的技术路线

蛋白质结构的研究需根据研究目标和样品特性选择合适的方法：

1.序列测定：优先选择质谱法或基因测序法。

2.二级结构分析：CD和FTIR是快速筛选工具。

3.高分辨率结构解析：

可结晶蛋白：X射线晶体学。

小分子量蛋白：NMR。

大分子复合物/膜蛋白：Cryo-EM。

4.动态结构研究：NMR或分子动力学模拟。

5.结构预测：同源建模或深度学习工具（如AlphaFold）。

 

蛋白质结构的层次性和测定方法的多样性，为深入理解生命过程提供了重要工具。随着技术的不断发展，尤其是Cryo-EM和深度学习的突破，蛋白质结构研究正进入一个全新的时代。