一、技术原理
蛋白质从头测序是一种不依赖任何已知蛋白质或DNA数据库信息，直接解析蛋白质氨基酸序列的技术。其核心原理基于质谱检测中肽段分子的规律性断裂：
1.酶切与断裂模式：蛋白质样品经蛋白酶酶切后，生成特定大小的多肽片段。这些肽段在质谱检测中会发生规律性断裂，产生不同离子类型（如b型、y型离子）。
2.质谱分析：通过质谱仪测定肽段离子的质荷比（m/z），获取肽段的碎片离子信息。
3.序列推导：利用碎片离子之间的质量差，结合生物信息学算法（如PEAKS、pNovo等），推导出肽段的氨基酸序列。
4.序列拼接：将推导出的肽段序列进行拼接，重建完整的蛋白质序列。
二、技术流程
蛋白质从头测序的流程主要包括以下步骤：
1.样品制备：
蛋白质提取：从生物样品中分离纯化目标蛋白质。
酶切处理：使用蛋白酶（如胰蛋白酶）将蛋白质酶切成多肽片段。为提高序列覆盖率，可采用多种蛋白酶进行多重酶切。
2.肽段分离与纯化：
高效液相色谱（HPLC）：利用HPLC对酶切后的肽段混合物进行分离纯化，去除杂质，提高质谱分析的准确性。
3.质谱分析：
软电离处理：肽段通过电喷雾电离（ESI）或基质辅助激光解吸电离（MALDI）技术带上电荷，进入质谱仪。
一级质谱分析：筛选肽段离子，确定其质荷比。
二级质谱分析：筛选后的肽段离子进入碰撞室，与惰性气体（如He、Ar）碰撞，诱导肽段共价键断裂，产生子离子。通过分析子离子的质荷比，获取肽段的碎片离子信息。
4.从头序列分析：
生物信息学分析：利用特定软件（如PEAKS AB）对二级质谱峰进行从头序列分析，推导出肽段的氨基酸序列。
序列拼接：根据肽段序列之间的重叠信息，将肽段序列拼接成完整的蛋白质序列。
5.序列验证：
分子量校验：利用质谱技术对拼接好的蛋白质序列进行分子量校验，确保测序结果的准确性。
反向验证：通过建立新的数据库，采用Sequence Confirmation模式对采集到的质谱数据再次分析，验证序列的准确性。
三、技术优势
1.不依赖数据库：无需任何已知蛋白质或DNA数据库信息，适用于新物种或基因组未测序物种的蛋白质序列分析。
2.高分辨率与灵敏度：采用高分辨率质谱仪（如Orbitrap Fusion Lumos），提高肽段分子量的准确性和测序结果的可信性。
3.翻译后修饰分析：可检测蛋白质的翻译后修饰（如磷酸化、糖基化），为蛋白质功能研究提供重要信息。
四、应用场景
1.抗体发现：在疾病相关抗体的研究中，从头测序技术可快速解析抗体的氨基酸序列，缩短测序周期，推动医疗诊断和治疗的发展。
2.重组蛋白鉴定：在重组蛋白的研究中，从头测序技术可验证重组蛋白的序列和翻译后修饰，确保其正确性。
3.工业蛋白研究：在工业生物技术中，从头测序技术可快速解析从环境中分离到的具有优异特性的蛋白质（如酶）的序列，推动其工业应用。
4.致敏蛋白鉴定：在食品科学中，从头测序技术可用于鉴定食物中的致敏蛋白，保障过敏人群的生命安全。
