原代细胞是直接取自活组织（例如活组织检查材料）的细胞，并建立用于体外生长。原代细胞分离是指将组织分散制成细胞悬液后从中获取目的细胞的过程，获得高纯度、高活性的原代细胞则是很多细胞实验成功的关键要素之一，原代细胞分离的方法有很多种：悬浮离心法、直接组织块法、酶消化法、非酶消化法、机械分散法等。

本文以同时使用机械分散法（200目过滤筛过滤）和酶消化法（主要方法）分离鸡胚成纤维细胞的分离培养为例详解原代细胞分离的实验步骤和注意事项。

一、实验器材与试剂的准备

1.9-11日龄鸡胚、1mL无菌移液枪头、水浴锅、蛋托、2B铅笔、照蛋器

2.高压灭菌器材：玻璃平皿、镊子、眼科剪、200目细胞筛绢、2mL EP管、15mL离心管

3.生物试剂：胰酶、灭菌PBS、胎牛血清、DMEM/F12培养液、青霉素和链霉素

二、实验前准备

1.配置：青霉素100U/ml，链霉素0.1mg/ml；含10%胎牛血清的DEME/F12培养液（加入1‰的青霉素和链霉素混合液）；0.25%胰酶

2.提前计算好所需的培养液：鸡胚可配置20-30mL的细胞液。

3.细胞间紫外提前照射20-30min。实验器材提前放入超净台。

三、实验步骤

1.取9-11日龄鸡胚放于蛋托中，大头朝上铅笔画出气室。

鸡胚结构图

2.用镊子背尖处敲开气室顶端，以画出的气室线上0.5mm为参考，用镊子夹取碎裂蛋壳。

3.此时会出现一层白色卵壳膜，换一把镊子将其由一边撕开（由高处向低处撕开壳膜，这样壳膜可直接挂于低端的蛋壳上），露出尿囊液。

4.避开血管、无菌取出胚体（夹取胸部可直接整个取出，力度要轻，不建议夹头，因为颈部易断），置于平板中。

5.去除头、翅、爪，剖开腹腔，去除内脏。

6.更换平皿，使用PBS冲洗1次，去除可见的红色血管组织（少量也不影响，后面会过滤消化掉），留淡粉色肌肉组织；再冲洗2次。

7.更换平皿，使用眼科剪将组织剪碎，约1mm3左右组织碎块。

8.剪碎组织放入2mm EP管中，加入组织5倍体积的0.25%胰酶，充分混匀。

9.37℃水浴锅消化5-25min，期间每3min 拿出摇晃混匀，直至组织碎块边缘出现絮状物为止（一般在5min 开始出现，10-15min时出现最多，具体看剪碎的组织大小，越小出现的越快）。

10.转移至15mL 离心管中用4-5mL的10%FBS DMEM/F12培养液加入管中钝化胰酶，充分吹打混匀；

11.200目细胞筛绢裁成5×5cm大小2张，折成漏斗状，放于15mL离心管上，将步骤10中混悬液4层过滤。

12.1000rpm离心3min，见离心管底部有白色细胞沉淀，弃去上清。

13.500-800μL 的10% FBS DMEM/F12培养液吹打重悬细胞悬液。

14.加入足量的10% FBS DMEM/F12培养液（20-30mL）混匀后分至细胞瓶中，于显微镜下观察有较多的散在球形细胞漂浮。

15.于37℃ 5% CO2培养箱中培养，长至70%-80%，更换2%-5% FBS DMEM/F12维持液（一般可维持10天，但7天内状态最佳），进行后续实验。

分离培养的CEF细胞

四、注意事项

1.注意无菌操作，确保所有的设备、器械与试剂均经过合理的除菌处理。

2.合理分离组织，如步骤5中需要将头、爪、翅、内脏的顺序依次剥离，然后将剩余组织置于新的平皿中。

3.组织块必须使用无菌PBS漂洗几次，目的是除去组织中的钙、镁离子和血清对胰蛋白酶和EDTA的抑制作用。

4.使用的胰酶浓度不宜过高，消化时间不宜过长，避免胰酶对细胞的毒性作用。如步骤9中消化过程一定要在旁边不停地观察，消化时间不宜过长，不要超过15min。一般10min左右就可以。

5.为避免过度的细胞机械性损伤，所有吹打力度均需控制均匀，在使用200目细胞筛绢过滤细胞时可采用无菌的注射器活塞轻轻撵开细胞团。

6.原代细胞有一定的生命周期，繁殖到一定代次（一般是10代以内）就会停止生长。一般认为：原代培养的第1代到第10代以内的细胞都认为是原代细胞。因此需要及时对细胞进行活度检测与传代，在细胞生长稳定后及时进行后续实验。