一、原理
BrdU（5-溴脱氧尿嘧啶核苷）是一种胸腺嘧啶核苷的类似物，能够在细胞增殖时期代替胸腺嘧啶渗入正在复制的DNA分子中。当细胞处于DNA合成期（S期）时，BrdU会被掺入到新合成的DNA链中。通过特定的抗体与DNA链上的BrdU发生抗原抗体反应，可以检测BrdU上的标记信号，从而判断细胞的增殖状态。
二、实验步骤
1.细胞培养：
将原代细胞以适当的密度接种于培养皿中，并放置盖玻片。
培养细胞至所需时间，通常培养1天，并用含特定浓度的血清培养液同步化细胞，使绝大多数细胞处于G0期。
2.加入BrdU：
终止细胞培养前，向培养液中加入终浓度为30μg/L的BrdU，并在37℃下孵育40分钟。
3.细胞固定与洗涤：
弃去培养液，用PBS洗涤玻片3次。
用甲醇/醋酸固定细胞10分钟。
灭活内源性氧化酶与封闭：
经固定的玻片空气干燥后，用0.3%H₂O₂-甲醇溶液灭活内源性氧化酶30分钟。
用5%正常兔血清封闭。
4.核酸变性：
用甲酰胺在100℃下处理5分钟，使核酸变性。
5.抗体孵育：
冰浴冷却后，用PBS洗涤玻片。
加入抗小鼠BrdU单抗（工作浓度1:50），阴性对照加PBS或血清。
6.检测与计数：
按ABC法进行检测，用苏木素或伊红衬染。
在显微镜下随机计数10个高倍视野中的细胞总数及BrdU阳性细胞数。
计算标记指数（LI），即BrdU阳性细胞数占总细胞数的比例。
三、注意事项
1.BrdU的光敏性：BrdU具有光敏性，见光易分解，因此需要避光存放和使用。
2.BrdU的稳定性：BrdU性质不稳定，尽量现配现用。
3.安全性：BrdU会对肌体造成不可逆损伤，实验过程中需注意安全使用。
四、应用
BrdU标记法主要用于直接测定DNA合成，是评估细胞增殖能力的准确方法之一。它常用于物质毒性测试、药物安全性评价以及细胞健康状态的评估。此外，该方法还可以用于研究细胞的生长和分裂，以及检测癌症细胞的增殖和活动。
