一、重组蛋白表达体系概述
1.原核表达系统
大肠杆菌表达系统：最为成熟和常用，适合小分子细胞质蛋白或结构域的表达。具有成本低、表达量高、操作简单等优点，但缺乏翻译后修饰机制，不适用于需要糖基化或特定位点切割等修饰的蛋白表达。
其他细菌表达系统：如枯草芽孢杆菌等，也有其特定的应用场景。
2.真核表达系统
酵母表达系统：如酿酒酵母、毕赤酵母等，适用于高密度发酵，能进行基本的翻译后修饰。适合生产糖基化蛋白质，但修饰类型有限。
昆虫细胞表达系统：适合表达较为复杂的真核蛋白质，如膜蛋白、大分子质量蛋白等。具有相对完善的修饰功能，但蛋白表达周期长，成本较高。
植物细胞表达系统：通常使用农杆菌介导的转化方法，适合进行高效的蛋白质修饰和表达。
哺乳动物表达系统：如HEK293或CHO细胞，能执行与人体细胞相似的翻译后修饰，适合生产具有哺乳动物生物活性的蛋白质。但操作成本高，表达效率相对较低。
无细胞表达系统：从质粒和PCR产物直接表达目的蛋白，表达体系来自于大肠杆菌、麦胚、兔网织红细胞等的无细胞提取物。优点是可自动化表达其他系统难以表达的产物，通量高，但表达量低、成本高昂。
二、重组蛋白表达体系的选择技巧
1.根据蛋白质特性选择：考虑蛋白质的大小、结构复杂性、后翻译修饰需求等因素。小型且结构简单的蛋白质适合大肠杆菌表达系统；需要复杂后翻译修饰的蛋白质则更适合真核表达系统。
2.根据实验目的选择：如果目的是功能研究，可能更关注表达的蛋白质活性和纯度；如果是大规模生产药物，则表达量成为关键因素。
3.考虑经济性和时效性：大肠杆菌表达系统成本最低、速度最快；而哺乳动物细胞表达系统成本最高、时间最长。
三、重组蛋白表达及使用常见问题解答
1.蛋白不表达：可能原因包括信号肽未去除、密码子位移、稀有密码子问题、GC含量太高、蛋白大小问题等。解决方法包括去除信号肽、优化密码子、降低GC含量、选择合适的标签等。
2.包涵体形成：原核表达中常见的问题，可能由于蛋白不正确折叠形成。解决方法包括降低诱导温度及诱导剂浓度、引入分子伴侣共表达、换专用感受态等。
3.蛋白降解：可能由于细菌本身的蛋白酶引起。解决方法包括在破胞及后续操作中保持低温、全程添加蛋白酶抑制剂等。
4.蛋白纯度不高：可能由于洗杂不彻底或分子伴侣与目的蛋白难以分离。解决方法包括多种纯化方式联用、更换表达感受态、标签联用等。
四、使用建议
1.密码子优化：根据表达系统的密码子偏好对DNA序列进行优化，提高翻译效率。
2.标签融合与切除：使用带有切割位点的融合标签，在表达完成后通过蛋白酶切除标签，获得功能性、无标签的蛋白质。
3.温度与诱导条件优化：调整诱导剂浓度和诱导时间，以及细菌培养中的温度、pH值、转速等参数，提高蛋白表达量和活性。
