一、构建方法
1. 正负筛选策略（Positive-negative selection, PNS）
原理：利用正负筛选策略结合Cre-Loxp重组系统的原理，构建牛朊蛋白基因prnp的敲除载体。正负筛选策略可以富集中靶细胞，提高基因打靶效率。
步骤：
设计载体：根据prnp基因序列，设计含有正负筛选基因和同源臂的打靶载体。
克隆同源臂：通过PCR技术从牛的全血基因组中扩增出prnp基因的两个同源臂（5'同源臂和3'同源臂）。
构建载体：将扩增出的同源臂插入到打靶载体中，构建牛朊蛋白基因敲除载体。
2. 同源臂扩增
引物设计：根据prnp基因序列，设计特异性引物，用于扩增5'同源臂和3'同源臂。
PCR扩增：以牛全血基因组DNA为模板，进行PCR扩增，得到5'同源臂和3'同源臂的扩增产物。
克隆与鉴定：将扩增产物连接到克隆载体上，转化感受态细胞，抽提质粒，经酶切及测序鉴定。
3. 载体构建
载体选择：选择通用型打靶载体PA2T作为基本骨架。
酶切与连接：将测序正确的克隆质粒与打靶载体PA2T同时用限制性内切酶双酶切，回收同源臂和骨架载体片段，通过T4 DNA连接酶连接。
转化与鉴定：将连接产物转化感受态细胞，提取质粒，经酶切、PCR鉴定，得到牛朊蛋白基因敲除载体PBONP。
二、转染技术
1. 电穿孔法
原理：电穿孔法是一种物理转染方法，通过施加短暂的高压电脉冲，在细胞膜上形成瞬时微孔，使外源DNA能够进入细胞内。
步骤：
细胞准备：选择生长活跃、状态健康、无污染、低代次的牛胎儿成纤维细胞，用PBS洗两遍，重悬于Opti-MEM无血清培养基中。
混合样品：将牛朊蛋白基因敲除载体PBONP加入细胞悬浮液中，混合均匀。
电穿孔：使用电穿孔仪，设置合适的电穿孔参数（如电压、脉冲时间、电容等），触发电穿孔，使载体进入细胞内。
2. 药物筛选
原理：利用正负筛选基因对转染后的细胞进行筛选，获得药物抗性细胞克隆。
步骤：
正筛选：用G418（新霉素）筛选含有正筛选基因的细胞克隆。
负筛选：用Ganciclovir（GCV）筛选去除含有负筛选基因的细胞克隆。
确定药物浓度：确立G418和GCV的最小细胞致死浓度和维持浓度，以保证药物筛选的有效性。
三、注意事项
1.细胞状态：选择生长活跃、状态健康、无污染、低代次的牛胎儿成纤维细胞进行转染，以提高转染效率和细胞存活率。
2.药物浓度：确定G418和GCV的最小细胞致死浓度和维持浓度，避免药物浓度过高导致细胞死亡，或浓度过低导致筛选无效。
3.鉴定方法：采用PCR、测序、间接免疫荧光试验及Western blotting试验对药物抗性细胞克隆进行鉴定，确定阳性细胞克隆。
4.无菌操作：在整个实验过程中，严格遵守无菌操作规程，避免污染。
四、常见问题及解决方案
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问题 |
可能原因 |
解决方案 |
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转染效率低 |
细胞状态不佳 |
改善细胞状态，选择健康、低代次的细胞 |
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载体构建不正确 |
优化载体构建，确保同源臂正确插入 |
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电穿孔参数不合适 |
调整电穿孔参数，如电压、脉冲时间等 |
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药物筛选无效 |
药物浓度不合适 |
调整药物浓度，确保筛选有效性 |
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筛选时间不足 |
延长筛选时间，确保药物作用充分 |
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阳性细胞克隆少 |
筛选策略不严格 |
优化筛选策略，提高筛选效率 |
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细胞克隆生长缓慢 |
改善细胞培养条件，促进细胞生长 |
