一、原理

电穿孔法是一种物理转染方法，通过施加短暂的高压电脉冲，在细胞膜上形成瞬时微孔，使带电荷的分子如DNA、RNA等能够进入细胞内。线性多核苷酸作为基因递送的载体，具有稳定性高、易于合成和修饰等优点。通过电穿孔法，可以将线性多核苷酸高效地递送到真核细胞中，实现基因表达和功能调控。这种方法操作简便、适用范围广、转染效率高，在基因治疗、疫苗开发和免疫治疗等领域具有广阔的应用前景。

 

二、步骤

1. 电转前准备

材料准备：

细胞：选择生长活跃、状态健康、无污染、低代次的真核细胞，如人类外周血单核细胞（PBMC）、单核细胞衍生的树突细胞（Mo-DC）等。

线性多核苷酸：根据实验需求选择合适的线性多核苷酸，如mRNA、DNA等。

细胞处理：

用PBS洗两遍细胞，去除残留的血清和杂质。

将细胞重悬于Opti-MEM无血清培养基中，调整细胞密度至合适范围（如2×106-4×106细胞/ml）。

混合样品：

加入线性多核苷酸，混合均匀，确保细胞与线性多核苷酸充分接触。

2. 吸液

样品池准备：

将细胞和线性多核苷酸混合物加入电穿孔仪的样品池中，注意不能有气泡。

3. 电转染

参数设置：

设置合适的电穿孔参数，如电压、脉冲时间、电容等。这些参数会影响转染效率和细胞存活率，需要根据细胞类型和实验需求进行优化。

触发电穿孔：

按照电穿孔仪的操作说明，触发电穿孔，使细胞和线性多核苷酸在电场作用下发生转染。

4. 分液

细胞培养：

将电穿孔后的细胞悬浮液转移到提前加入培养基的培养皿中，让转染细胞恢复生长条件。

5. 分析细胞

转染效率检测：

在转染后不同时间点，使用流式细胞仪、荧光显微镜等方法检测线性多核苷酸的表达水平和细胞存活率。

细胞功能评估：

根据实验需求，对转染后的细胞进行功能评估，如基因表达、蛋白分泌、细胞增殖等。

 

三、注意事项

1. 电穿孔参数选择

外加电场强度：

电压过低可能无法形成足够的微孔，导致转染效率低；电压过高可能损伤细胞，导致细胞存活率下降。一般来说，哺乳动物细胞的电压范围在250-500V/cm。

脉冲波形：

脉冲波形主要分为方波脉冲和指数递减脉冲波。方波脉冲具有较高的转染效率和细胞存活率，适用于大多数哺乳动物细胞。

脉冲时程：

脉冲时间的选择取决于脉冲波形和细胞类型。方波脉冲的脉冲时间可直接设定；指数递减脉冲波的脉冲时间是指电压衰减至初始电压1/3时所用的时间。

2. 细胞因素

细胞状态：

选择生长活跃、状态健康、无污染、低代次的细胞可获得最佳转染效果。

细胞密度：

细胞密度过高可能导致细胞相互作用增大，影响电穿孔效果。一般来说，细胞密度应控制在2×106-4×106细胞/ml。

3. 线性多核苷酸因素

纯度：

选择纯度高的线性多核苷酸，避免蛋白质、RNA和其他化学物质的污染。

浓度：

控制线性多核苷酸的浓度在合适范围内，过高的浓度可能导致细胞毒性增加，过低的浓度可能导致转染效率低。

4. 温度

电穿孔温度：

电穿孔过程中细胞的温度也会影响转染效率。一般来说，室温下进行电穿孔可获得较好的转染效果。

5. 缓冲液和培养液成分

电转前培养液：

根据细胞类型选择合适的培养基，真核细胞常用PRMI1640+10%FCS（胎牛血清）培养。

电转缓冲液：

选择合适的电穿孔缓冲液，确保细胞在电穿孔过程中保持稳定的渗透压和离子环境。

电转后培养液：

电穿孔后，将细胞置于含有适当营养成分的培养基中，促进细胞恢复和生长。

 

四、常见问题及解决方案

问题	可能原因	解决方案
转染效率低	电穿孔参数不合适	优化电穿孔参数，如电压、脉冲时间等
	细胞状态不佳	改善细胞状态，选择健康、低代次的细胞
	线性多核苷酸纯度低	提高线性多核苷酸纯度
细胞存活率低	电穿孔参数过高	降低电穿孔参数，如电压、脉冲时间等
	细胞密度过大	控制细胞密度在合适范围内
	缓冲液成分不合适	优化缓冲液成分，确保细胞稳定

 

通过以上指南，您可以更顺利地开展线性多核苷酸通过电穿孔增强真核细胞转染的实验，提高转染效率和细胞存活率。如有问题，建议查阅相关文献或联系技术支持。