NF-κB信号通路在细胞免疫反应中扮演着至关重要的角色，它能够调控多种基因的表达，从而影响细胞的存活、增殖和炎症反应。NF-κB通常在细胞质中与抑制蛋白IκB结合，处于非活性状态。当细胞受到外界刺激（如TNF-α、LPS等）时，IκB被磷酸化并降解，释放出NF-κB，使其能够移位到细胞核中，激活下游基因的转。检测NF-κB的核移位对于理解细胞如何响应外界刺激至关重要。免疫荧光技术因其高特异性和直观性，成为研究NF-κB核移位的常用方法之一。通过免疫荧光染色，可以清晰地观察到NF-κB在细胞核中的定位，从而为研究NF-κB信号通路的调控机制提供有力支持。

 

一、实验材料与试剂准备

（一）细胞培养材料

1.细胞培养皿：根据实验需求选择合适的培养皿，如6孔板、12孔板或24孔板。确保培养皿表面清洁，无划痕。

2.培养基：选择适合细胞生长的培养基，如DMEM、RPMI 1640等。确保培养基新鲜，无污染。

3.血清：通常使用10%胎牛血清（FBS）作为补充剂，以提供细胞生长所需的营养成分。确保血清无菌，无支原体污染。

4.胰蛋白酶：用于细胞传代，浓度通常为0.25%。使用前需平衡至室温，避免过冷对细胞造成损伤。

（二）免疫荧光试剂

1.NF-κB抗体：选择高特异性的NF-κB抗体，推荐使用兔抗NF-κB p65抗体（如Cell Signaling Technology，货号8242）。

2.二抗（荧光标记）：选择与一抗匹配的荧光标记二抗，如山羊抗兔IgG（H+L）Alexa Fluor 488（如Thermo Fisher Scientific，货号A-11008）。

3.DAPI（细胞核染色剂）：用于标记细胞核，浓度为1 μg/mL。DAPI能够与DNA结合，发出蓝色荧光，便于观察细胞核位置。

4.封片剂：使用抗荧光淬灭封片剂，如ProLong Diamond Antifade Mountant（Thermo Fisher Scientific，货号P36971），以保护荧光信号。

（三）其他试剂

1.PBS缓冲液：用于细胞洗涤，确保pH值在7.2 - 7.4之间。可以自行配制或购买现成的PBS缓冲液。

2.固定液：常用4%多聚甲醛固定细胞，能够较好地保留细胞结构和抗原性。

3.封闭液：使用5% BSA或正常山羊血清作为封闭液，能够有效封闭非特异性结合位点，减少背景染色。

 

二、细胞培养与处理

1.细胞培养

培养基配制：将培养基与10%胎牛血清混合，确保血清充分溶解。使用前需平衡至37°C，避免温度差异对细胞造成应激。

2.细胞传代：

从液氮罐中取出细胞，迅速放入37°C水浴锅中，轻轻晃动，使细胞迅速融化。

将细胞悬液转移至含有培养基的离心管中，轻轻吹打混匀。

以1000 rpm离心5分钟，弃上清，加入新鲜培养基重悬细胞。

按照1:3或1:4的比例将细胞接种至新的培养皿中，轻轻晃动培养皿，使细胞均匀分布。

将培养皿放入37°C、5% CO₂的培养箱中培养，定期观察细胞生长状态。

3.培养时间：根据细胞类型和实验需求确定培养时间。一般来说，细胞在传代后的24 - 48小时内能够较好地贴壁生长，达到实验所需的细胞密度。

刺激处理

刺激剂选择：选择合适的刺激剂诱导NF-κB移位入核，如TNF-α。TNF-α是一种常见的炎症因子，能够有效激活NF-κB信号通路。

刺激浓度和时间：根据细胞类型和实验需求确定TNF-α的浓度和处理时间。一般来说，TNF-α的浓度为10 - 50 ng/mL，处理时间为30分钟 - 2小时。

以10 ng/mL的TNF-α为例，将TNF-α溶液加入细胞培养基中，使最终浓度达到10 ng/mL。

将培养皿放回37°C、5% CO₂的培养箱中，处理30分钟。

处理结束后，将培养基吸出，用PBS缓冲液轻轻洗涤细胞2 - 3次，以去除未结合的TNF-α。

固定与透化

固定细胞：

吸出PBS缓冲液，加入4%多聚甲醛固定液，使细胞完全浸没在固定液中。

在室温下固定15 - 30分钟，根据细胞类型和实验需求调整固定时间。固定时间过长可能导致细胞结构过度硬化，影响后续染色效果。

固定结束后，用PBS缓冲液轻轻洗涤细胞3次，每次5分钟，以去除残留的固定液。

透化步骤：

选择合适的透化剂，如甲醇或Triton X-100。甲醇能够较好地透化细胞膜，但可能会破坏部分细胞结构；Triton X-100透化效果温和，对细胞结构的破坏较小。

以Triton X-100为例，加入0.1% Triton X-100溶液，室温孵育10 - 15分钟。

透化结束后，用PBS缓冲液轻轻洗涤细胞3次，每次5分钟，以去除残留的透化剂。

通过以上步骤，细胞已经准备好进行免疫荧光染色。接下来，我们将详细介绍免疫荧光染色的具体步骤，包括封闭、一抗孵育、二抗孵育、核染色和封片等环节。

 

三、免疫荧光染色步骤

1.封闭

封闭液准备：使用5% BSA（牛血清白蛋白）作为封闭液。将5 g BSA溶于100 mL PBS缓冲液中，搅拌均匀，确保完全溶解。

封闭操作：

1.吸出细胞培养皿中的PBS缓冲液，加入适量的封闭液，确保细胞完全浸没。

2.将培养皿置于37°C培养箱中，封闭30分钟至1小时。封闭时间过短可能导致背景染色，过长则可能影响抗体结合。

3.封闭结束后，用PBS缓冲液轻轻洗涤细胞3次，每次5分钟，以去除残留的封闭液。

2.一抗孵育

一抗稀释：根据抗体说明书，将NF-κB特异性抗体（如兔抗NF-κB p65抗体）稀释至适当浓度，通常为1:100 - 1:500。例如，取1 μL抗体加入到99 μL PBS缓冲液中，混合均匀。

一抗孵育：

1.吸出封闭液，加入稀释好的一抗溶液，轻轻晃动培养皿，使抗体均匀覆盖细胞。

2.将培养皿置于4°C冰箱中，孵育过夜（12 - 16小时）。低温孵育有助于抗体与抗原的充分结合，提高染色特异性。

3.孵育结束后，用PBS缓冲液轻轻洗涤细胞3次，每次5分钟，以去除未结合的抗体。

3.洗涤

洗涤操作：使用PBS缓冲液轻轻洗涤细胞3 - 5次，每次5分钟。洗涤时动作要轻柔，避免细胞脱落。

1.每次洗涤后，轻轻甩去多余的液体，但不要完全吸干，以免细胞干燥。

2.洗涤过程中，可以轻轻晃动培养皿，帮助去除未结合的抗体。

4.二抗孵育

二抗稀释：将荧光标记的二抗（如山羊抗兔IgG Alexa Fluor 488）稀释至适当浓度，通常为1:500 - 1:1000。例如，取2 μL二抗加入到998 μL PBS缓冲液中，混合均匀。

二抗孵育：

1.吸出一抗溶液，加入稀释好的二抗溶液，轻轻晃动培养皿，使二抗均匀覆盖细胞。

2.将培养皿置于室温下，避光孵育1小时。避光操作是关键，因为荧光染料在光照下容易淬灭。

3.孵育结束后，用PBS缓冲液轻轻洗涤细胞3次，每次5分钟，以去除未结合的二抗。

5.核染色

DAPI染色：

1.准备1 μg/mL的DAPI溶液。取1 μL DAPI（10 mg/mL）加入到10 mL PBS缓冲液中，混合均匀。

2.吸出二抗溶液，加入DAPI溶液，轻轻晃动培养皿，使DAPI均匀覆盖细胞。

3.将培养皿置于室温下，避光孵育5 - 10分钟。DAPI染色时间不宜过长，以免过度染色。

4.孵育结束后，用PBS缓冲液轻轻洗涤细胞3次，每次5分钟，以去除残留的DAPI溶液。

6.封片

封片剂准备：使用抗荧光淬灭封片剂（如ProLong Diamond Antifade Mountant）。

封片操作：

1.吸出DAPI溶液，用吸水纸轻轻吸去多余的液体，但不要完全吸干。

2.在培养皿中加入适量的封片剂，轻轻晃动培养皿，使封片剂均匀覆盖细胞。

3.将盖玻片轻轻放在封片剂上，避免产生气泡。如果使用培养皿，可以直接将封片剂滴在细胞上，然后用盖玻片覆盖。

4.将封好的玻片置于室温下，自然干燥后即可进行显微镜观察。

 

四、显微镜成像与分析

1.显微镜选择

荧光显微镜：推荐使用荧光显微镜进行成像。荧光显微镜能够提供清晰的荧光信号，适合观察NF-κB的核移位。

共聚焦显微镜：如果需要更高分辨率的图像，可以使用共聚焦显微镜。共聚焦显微镜能够提供更清晰的细胞核和细胞质的分层图像，有助于更准确地分析NF-κB的定位。

2.成像参数

曝光时间：根据荧光信号的强度调整曝光时间。一般来说，Alexa Fluor 488的曝光时间在100 - 500毫秒之间，DAPI的曝光时间在10 - 50毫秒之间。曝光时间过长可能导致荧光饱和，过短则信号过弱。

放大倍数：选择合适的放大倍数进行成像。通常使用20×或40×物镜，能够清晰地观察到细胞核和细胞质的细节。

光圈和焦距：调整显微镜的光圈和焦距，确保图像清晰、背景干净。光圈不宜过大，以免背景噪声过高。

3.图像分析

软件选择：使用图像分析软件（如ImageJ）进行定量分析。ImageJ是一款免费的开源软件，功能强大，适合进行荧光信号的定量分析。

分析步骤：

打开ImageJ软件，导入荧光图像。

使用“Freehand Selection”工具，手动勾勒出细胞核和细胞质的区域。

选择“Analyze”菜单中的“Measure”功能，测量细胞核和细胞质的荧光强度。

计算NF-κB在细胞核中的相对荧光强度，公式为：

对多个细胞进行测量，取平均值以获得更可靠的统计结果。

 

五、常见问题与注意事项

1.抗体选择

抗体质量：选择高质量、特异性好的抗体至关重要。推荐使用经过验证的抗体，如Cell Signaling Technology或Thermo Fisher Scientific的产品。

抗体稀释：根据抗体说明书进行稀释，避免浓度过高导致背景染色，或浓度过低导致信号过弱。

2.背景染色

优化封闭：适当延长封闭时间（30分钟至1小时），确保非特异性结合位点被充分封闭。

调整抗体浓度：适当降低一抗和二抗的浓度，减少背景染色。

洗涤步骤：增加洗涤次数和时间，确保去除未结合的抗体。

3.实验重复性

多次实验：建议进行多次实验重复（至少3次），以确保结果的可靠性和可重复性。

记录详细信息：记录每次实验的详细条件，包括抗体浓度、孵育时间、温度等，便于后续分析和重复实验。

4.温度与时间控制

温度控制：严格控制实验过程中的温度，特别是固定、封闭和抗体孵育步骤。温度差异可能导致细胞结构变化或抗体结合效率不同。

时间控制：严格按照操作步骤中的时间进行操作，避免时间过长或过短对实验结果的影响。

5.数据记录

详细记录：记录每次实验的详细条件，包括细胞类型、培养条件、刺激处理、抗体信息、孵育时间、温度等。

图像保存：保存原始图像和分析结果，便于后续查阅和发表。

 

通过以上详细的步骤和注意事项，您可以更准确地检测NF-κB的核移位，为研究NF-κB信号通路提供有力支持。希望这些内容对您的实验有所帮助！